Matériel et méthodes

3.1. Liste des produits chimiques utilisés

Les différents produits chimiques utilisés dans ce chapitre sont listés dans le Tableau 1. Tableau 1 : Liste des produits chimiques utilisés

Produits chimiques CAS Fournisseur Pureté

Heptane 142-82-5 Sigma Aldrich ≥ 99 %

Méthanol 67-56-1 Sigma Aldrich ≥ 99,9 %

Méthyl t-butyl éther 1634-04-4 Sigma Aldrich ≥ 99,0 %

Ethanol 64-17-5 Sigma Aldrich ≥ 96 %

1-Butanol 71-36-3 Sigma Aldrich ≥ 99,7 %

Acétonitrile 75-05-8 Sigma Aldrich ≥ 99,9 %

New coccine red 2611-82-7 Sigma Aldrich 75 %

β-carotène 7235-40-7 Sigma Aldrich ≥ 97 %

Extrait fluide romarin - Cooper industries -

Extrait sec romarin - Cooper industries -

Carnosol 5957-80-2 Phytolab ≥ 90 %

Acide carnosique 3650-09-7 Phytolab ≥ 90 %

Acide rosmarinique 20283-92-5 Phytolab ≥ 95 %

3.2. HPLC

3.2.1. Instrumentation

La méthode d’analyse HPLC est réalisée dans nos laboratoires sur une HPLC Alliance Waters 2690 équipée d’un détecteur UV à barrette de diodes sur laquelle est montée une colonne Agilent technologies Zorbax SB-Aq 3x150 mm, 5μm. La colonne Zorbax SB-Aq est une colonne phase inverse greffée alkyle principalement conçue pour retenir des composés hydrophiles lors de l’utilisation de phases mobiles aqueuses.

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3.2.2. Préparation des échantillons

Les deux extraits de romarin du commerce n’étant pas sous la même forme, chacun est préparé de manière différente.

L’extrait fluide est dilué par 100 dans de l’eau Elga avant injection.

Pour l’extrait sec, 1g est pesé et mis en contact avec 10 mL de méthanol. Après avoir été laissé 15 minutes aux ultrasons, l’extrait est laissé une nuit en contact avec le méthanol. Le lendemain, l’extrait

est centrifugé à 5000 rpm durant 10 minutes et le surnageant récupéré afin de se séparer des parties non dissoutes. L’extrait est alors dilué par 100 dans de l’eau Elga avant d’être injecté.

Les standards de carnosol et d’acide rosmarinique sont préparés à 250 μg/mL dans du méthanol. Le standard d’acide carnosique est quant à lui préparé à 170 μg/mL de méthanol.

3.2.3. Analyse des échantillons

En accord avec les caractéristiques de la colonne (cf. Tableau 6 p. 39), cette dernière est utilisée à un débit de 0,4 mL/min. Le volume d’injection de chaque échantillon est de 20 μL. La longueur d’onde de détection est fixée à 214 nm.

3.3. Shake-flask

Pour chaque système solvant testé, la préparation des échantillons est exécutée comme suit : 400 mg d’extrait de romarin fluide ou sec est pesé et transféré dans un flacon contenant 2 mL de phase supérieure et 2 mL de phase inférieure du système solvant à tester pour la purification. Le flacon est ensuite vigoureusement agité puis placé 15 minutes aux ultrasons afin de dissoudre la plus grande quantité possible de solutés. Les deux phases sont ensuite séparées et centrifugées à 5000 rpm durant 2 minutes afin de regrouper au fond du tube les composés non solubles dans le système solvant. Chaque phase contenant les solutés est ensuite prélevée et diluée par 10 avec la même phase vierge avant d’être injectée en HPLC, en utilisant la même méthode que celle développée pour l’analyse des extraits. Un blanc de chaque phase est injecté en amont afin de vérifier qu’aucun pic de solvant n’apparait sur le chromatogramme HPLC ou si un pic apparait, qu’il puisse être assimilé au solvant et non à une impureté. Les aires des pics chromatographiques des différents solutés contenus sur le chromatogramme sont ensuite calculées à l’aide du logiciel Azur (Datalys).

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3.4. Chromatographie de Partage Centrifuge

3.4.1. Instrumentation

Le rotor utilisé dans le cadre du développement de méthode de purification du romarin est un rotor Kromaton (Rousselet-Robatel, Annonay, France) de 35 mL monté sur un bâti FCPC-A.

Un refroidisseur F10-C Julabo (Colmar, France) est branché au système afin de réfrigérer la chambre du rotor et ainsi empêcher de fortes variations de températures. En effet, la rotation appliquée au système peut créer des échauffements au niveau des raccords rotatifs pouvant induire une augmentation de température du système solvant et donc une modification de la composition de ce dernier. Ceci peut alors avoir pour effet une variation du taux de phase stationnaire dans la colonne ainsi qu’une modification des coefficients de partage des composés ayant pour conséquence directe une modification de leur séparation.

Le système de pompage et de détection est assuré par un Spot Prep II Armen Instrument (Saint-Avé, France). Il comprend une pompe quaternaire (débits applicables compris entre 1 et 250 mL, avec une pression maximale de 230 bar). Le système est équipé d’une vanne d’injection automatique sur laquelle est montée une boucle de 10 mL. L’appareil est doté d’un système de détection UV double longueur d’onde fixée à 210 et 254 nm. L’emploi d’un collecteur de fraction est également possible sur cet instrument, mais ne sera pas utilisé dans le cadre du développement de méthode de purification. Le contrôle de l’appareil et l’acquisition des données est assuré par le logiciel Armen Glider Prep.

3.4.2. Utilisation de l’appareil de CPC

Au début de chaque journée d’utilisation de l’appareil de CPC, le refroidisseur est mis en route et régulé à 0°C. Lors d’un changement de système solvant, le rotor est rincé avec les deux phases du nouveau

système pour évacuer toutes traces de l’ancien. Le rinçage est effectué à faible vitesse de rotation (600 rpm) afin de répartir les solvants de manière homogène dans les cellules circulaires et canaux du

rotor via la force de Coriolis.

Pour une expérience donnée, le rotor est ensuite entièrement chargé en phase stationnaire, toujours à 600 rpm. Une vitesse de rotation appropriée est ensuite appliquée, puis la phase mobile est pompée à travers la phase stationnaire au débit qui sera ensuite utilisé pour l’élution afin d’équilibrer la colonne. La phase mobile pousse alors l’excédent de phase stationnaire non retenue. Lorsque l’équilibre est atteint, il n’y a plus que de la phase mobile qui sort de la colonne, la ligne de base devient généralement stable.

Le taux de phase stationnaire est calculé soit par déplacement (collecte et mesure de la quantité de phase stationnaire non retenue dans la colonne pour en déduire la quantité de phase mobile contenue dans la colonne), soit par injection d’un composé non retenu indiquant directement le volume mort ou volume de phase mobile dans la colonne. Ainsi, en connaissant le volume de la colonne, il est possible d’en déduire la proportion de phase stationnaire contenue dans le rotor aux conditions opératoires choisies.

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3.4.3. Préparation et injection de l’extrait de romarin

5 g d’extrait sec de romarin sont introduits dans 10 mL de phase supérieure ou inférieure du système solvant de manière à extraire le plus de carnosol possible, puis mis aux ultrasons durant 10 minutes afin de solubiliser une quantité maximale de composés. L’échantillon est ensuite centrifugé à 5000 rpm durant 3 min afin de décanter les composés non solubles au fond du tube et de récupérer la partie supérieure contenant les molécules solubilisées.

La colonne de CPC est ensuite chargée en phase stationnaire puis équilibrée à vitesse de rotation et débits choisis. Lorsque la ligne de base est stable, 1 mL d’extrait de romarin est injecté. La longueur d’onde de détection est fixée à 210 nm. Une seconde longueur d’onde de 254 nm est laissée par défaut sur le détecteur. En fin d’élution, une extrusion est réalisée. Elle consiste à pomper de la phase stationnaire à la place de la phase mobile afin de faire sortir les composés très, voire infiniment retenus, et donc de rincer la colonne.