Système butanol/méthanol/eau 5/1/4

4.2.2.1. Construction du système solvant

Le carnosol étant un composé à polarité intermédiaire (44), l’utilisation d’un système plutôt polaire (26) tel que le système butanol/méthanol/eau peut être intéressant. Ce système solvant est un système biphasique bien connu car étudié à travers le tracé d’un diagramme ternaire par Foucault dans son livre dédié à la CPC (26). Ce diagramme correspond au mélange du méthanol, miscible à deux autres solvants immiscibles (le butanol et l’eau).

La composition du système solvant butanol/méthanol/eau a été orientée vers des proportions 5/1/4 (v/v). Ces dernières ont été choisies pour avoir : (i) des volumes simples à mesurer lors de la création du système solvant ; (ii) un maximum de méthanol possible, considéré ici comme le « meilleur solvant », tout en ayant deux phases ; (iii) le moins d’eau possible, le carnosol y étant très peu soluble ; (iv) et en gardant des quantités de phases supérieure et inférieure les plus égales possibles. Le système solvant butanol/méthanol/eau en proportions 5/1/4 (v/v) comporte une phase supérieure composée de 65% de butanol, 9% de méthanol et 26% d’eau. La phase inférieure est quant à elle composée de 10% de butanol, 12,5% de méthanol et 77,5% d’eau (Figure 18). La quantité initiale de méthanol n’a pas été augmentée au-delà de 10% pour ne pas s’approcher trop près du point de plissement et de la courbe binodale.

0 0,05 0,1 0,15

Ethanol Acétone Acétate d'éthyle Hexane Eau Mas se (en g)

Chapitre 2 : Purification du carnosol par CPC : développement de la méthode à petite échelle | 43

Figure 18 : Diagramme ternaire du système solvant 1-butanol/méthanol/eau. Afin d’avoir un système solvant composé de deux phases, la proportion de méthanol ne doit pas excéder 17%.

4.2.2.2. Test du système solvant par shake-flask

Un shake-flask est réalisé comme indiqué au §3.3. Le résultat des analyses HPLC des phases supérieures et inférieures est visible Figure 19.

L’observation des chromatogrammes montre qu’il y a plus de carnosol dans la phase supérieure (en bleu) tandis que la quantité d’acide rosmarinique contenue dans les phases supérieures et inférieures semble presque identique. Les coefficients de partage de l’acide rosmarinique, du carnosol et des composés à polarité proche du carnosol (probables interférents) sont calculés dans les deux modes (ascendant ou descendant) (Tableau 7).

Pour une utilisation du système solvant butanol/méthanol/eau en mode ascendant, les coefficients de partage théoriques des composés semblent très proches. Il y a un fort risque pour que, quel que soit le taux de phase stationnaire, le carnosol (Kdthéorique = 0,10) ne soit pas séparé d’un grand nombre d’autres molécules (Kdthéoriques = 0,16 ; 0,17 ; 0,19 ; 0,21 ; 0,23). Ce système solvant ne sera donc pas testé en CPC en mode ascendant. Dans le cas de l’utilisation du système solvant butanol/méthanol/eau 5/1/4 (v/v) en mode descendant, les coefficients de partage des composés s’inversent et apparaissent beaucoup plus éloignés. Un test de séparation peut donc être réalisé en CPC.

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Figure 19 : Chromatogramme HPLC des phases supérieures et inférieures lors d’un shake-flask sur le système solvant butanol/méthanol/eau 5/1/4 (v/v). En insert, zoom sur les temps de rétention entre 40 et 50 minutes.

Conditions opératoires § 3.2.3 et gradient utilisé en Tableau 6.

Tableau 7 : Coefficients de partage théoriques de l’acide rosmarinique, du carnosol et des pics compris entre 37 et 46 minutes par analyse HPLC des phases supérieures et inférieures du système butanol/méthanol/eau en

proportions 5/1/4 (v/v). Composé Temps rétention (min) Aire du pic en phase supérieure Aire du pic en phase inférieure Kdthéorique ascendant = phase stationnaire inférieure Kdthéorique descendant = phase stationnaire supérieure Acide rosmarinique ^{22,50 2086 2162 0,96 1,04} 37,08 39 169 0,23 4,37 38,82 34 199 0,17 5,90 Carnosol 41,55 27 265 0,10 9,98 42,00 11 53 0,21 4,79 43,55 19 97 0,19 5,20 45,02 11 83 0,14 7,20 Phase supérieure Phase inférieure Carnosol Carnosol

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4.2.2.3. Test du système solvant en mode descendant

Le système solvant butanol/méthanol/eau 5/1/4 (v/v) est testé en CPC en mode descendant. Dans ce mode d’utilisation, la phase mobile est principalement aqueuse.

La première phase consiste à mettre en place des conditions opératoires afin de retenir un maximum de phase stationnaire et permettant ainsi la réalisation d’une séparation. Pour cela, plusieurs conditions opératoires seront testées et les taux de phase stationnaire calculés. A l’aide des coefficients de partage théoriques, une estimation des volumes de rétention et donc des temps de rétention pourra être effectuée et ainsi la séparation évaluée.

Dans un premier temps, la vitesse de rotation la plus importante possible est appliquée. On surveille que la pression maximale autorisée pour l’utilisation des raccords rotatifs reste en dessous de 70 bars. En effet, plus la vitesse de rotation est importante, meilleure est la rétention de phase stationnaire, plus les phénomènes de perte de phase stationnaire en cours d’élution sont faibles et plus l’efficacité chromatographique est importante (45-47). En revanche, la pression de travail est plus élevée (Équation 6 p.16). Ainsi, la vitesse de rotation est directement ajustée à 3000 rpm, vitesse de rotation maximale possible sur les appareillages Kromaton.

Le choix du débit de phase mobile est également une étape très importante dans la sélection des conditions opératoires. Ce dernier a une influence directe sur la durée de purification ainsi que sur le taux de phase stationnaire. Plus le débit est important, plus le taux de phase stationnaire est faible. Le temps d’élution est cependant beaucoup plus court. La durée de purification n’est pas un paramètre déterminant dans l’étape développement de méthode. En effet, même s’il est judicieux de ne pas choisir des débits trop lents pour ne pas avoir des temps d’élution trop longs, l’utilisateur a intérêt à avoir des taux de phase stationnaires raisonnables afin d’augmenter les chances de séparation des composés. C’est seulement lors de l’étape d’optimisation de la production qu’une augmentation du débit pourra être envisagée. Un paragraphe sera consacré à ces notions lors du Chapitre 3. Un débit de 3 mL/min est donc appliqué lors de ce test (Tableau 8).

Tableau 8 : Taux de phase stationnaire et pression du système en fonction de différentes vitesses de rotation à 3 mL/min. Système butanol/méthanol/eau en proportions 5/1/4 (v/v), mode descendant (phase mobile aqueuse).

Vitesse de

rotation ^{Débit Pression}

Taux de phase stationnaire 3000 rpm 3 mL/min 13 bar 22 % 2000 rpm 18 bar 33 % 1600 rpm 33 bar 30 %

Le Tableau 8 montre qu’à 3000 rpm et 3 mL/min, le taux de phase stationnaire contenu dans la colonne est très faible (22 %). Il a été indiqué précédemment que la vitesse de rotation maximale permettait d’avoir un taux de phase stationnaire maximal. Cependant, il arrive parfois que le système solvant utilisé soit sensible à la température et à l’échauffement dû à une forte vitesse de rotation. Ainsi, deux vitesses de rotation plus faibles sont testées afin de voir si les taux de phase stationnaire sont meilleurs : 2000 et 1600 rpm pour un débit de 3 mL/min. L’observation des résultats montre qu’à ces deux champs centrifuges, les taux de phase stationnaire sont meilleurs. Cependant, ils restent très faibles puisque

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jamais supérieurs à 33%. Un nouveau test pourrait être effectué à débit plus faible, mais les temps de purifications risquant de devenir beaucoup trop longs, un changement de système solvant est préférable.