Optimisation de la production sur rotor analytique 35 mL

La méthode de purification du carnosol provenant d’un extrait de romarin a été développée d’un point de vue chimique (choix du système solvant et de sa composition) au cours du chapitre 2. Elle consiste à injecter et réaliser la séparation des composants d’un extrait éthanolique sec de romarin afin d’en isoler la molécule de carnosol. Ceci est réalisé à l’aide du système solvant heptane/MTBE/éthanol/eau en proportions 4/1/4/1 (v/v), utilisé en mode ascendant.

Lors de la présentation de la méthodologie de scale-up, nous avons pu mettre en évidence un point très important en chromatographie préparative : l’optimisation des conditions opératoires en fonction de l’objectif de production. Même si cela n’est pas fondamentalement nécessaire puisqu’il n’est pas destiné à la production, nous avons cherché à optimiser le procédé sur rotor analytique afin de pouvoir comparer ses qualités de charge et de productivité avec les rotors de taille semi-préparative (254 mL) et pilote (812 mL).

Chapitre 3 : Méthodologie de transfert d’échelle | 97

5.1.1.1.

La détermination des conditions opératoires optimales est réalisée en 5 injections à 5 débits successifs, de 5 à 15 mL/min. La vitesse de rotation est gardée constante à 2200 rpm car elle est considérée comme la vitesse de rotation maximale, permettant une bonne rétention de phase stationnaire (54% à 5 mL/min) sans engendrer une pression trop élevée (P = 47 bar à l’injection). Pour cela, 0,5 mL d’échantillon sont injectés (≈ 1 % du volume colonne). Le ∆V et le ∆V/t entre le pic de carnosol et l’impureté le précédant sont calculés pour chaque débit (Figure 47). Pour le calcul du ∆V/t, t correspond ici au temps d’élution de la colonne, auquel s’ajoutent les temps d’équilibration et d’extrusion.

Figure 47 : Evolution (a) du ΔV et (b) du ΔV/t entre les pics de carnosol et l’impureté précédente en fonction du débit sur le rotor analytique 35 mL à 2200 rpm.

L’observation de la Figure 47 montre qu’un débit de 5 mL/min permet d’obtenir un espace disponible ∆V le plus grand dans la gamme de débits testés (chromatogramme présenté Figure 48). La meilleure productivité est quant à elle obtenue à 10 mL/min puisque c’est à ce débit que le ∆V/t est maximal. La détermination de la charge maximale sera donc effectuée à ces deux débits, dont les valeurs des ∆V sont regroupées dans le Tableau 23.

0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 ∆V (mL) Débit (mL/min) 0 20 40 60 80 0 5 10 15 20 ∆V/T (mL/h) Débit (mL/min) (a) (b)

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Figure 48 : Injection analytique de l’extrait de romarin. Système solvant heptane/MTBE/éthanol/eau 4/1/4/1 (v/v) utilisé en mode ascendant. Rotor analytique 35 mL, 2200 rpm, 5 mL/min, Vinj = 0,5 mL, Sf = 54 %,

P = 48 bar. Détection UV λ = 210 nm.

Tableau 23 : Valeurs des ∆V entre les pics de carnosol et l’impureté précédente à ∆Vmax et ∆V/tmax sur le rotor 35 mL utilisé en système solvant heptane/MTBE/éthanol/eau 4/1/4/1 (v/v) à 2200 rpm.

Objectif Critère Débit Valeur du ∆V

Opération ∆Vmax 5 mL/min 18,7 mL

Productivité ∆V/tmax 10 mL/min 13,2 mL

5.1.1.2.

L’étude de la quantité maximale injectable sur le petit rotor analytique 35 mL est réalisée dans un premier temps à 5 mL/min. Les critères fixés pour l’étude de la charge est un retour à la ligne de base entre les pics de carnosol et les impuretés environnantes, permettant une pureté du carnosol avoisinant les 100%. Le pic le plus proche est situé en amont du pic de carnosol, c’est ce dernier qui sera surveillé en priorité. L’étude de la charge est effectuée sur 4 injections de 1,0 mL à 2,5 mL (Figure 49). Les injections à 1,0 et 1,5 mL montrent un retour à la ligne de base correct, tandis que sur les deux injections plus chargées (2,0 et 2,5 mL), le retour à la ligne de base ne semble pas respecté.

On remarque sur les chromatogrammes de la Figure 49 que plus la quantité d’échantillon injectée est importante, plus il y a perte de phase stationnaire. En effet, les pics sortants au temps mort (entre 3,5 et 4,3 minutes) sortent plus tard, traduisant un volume mort plus important et donc un taux de phase stationnaire plus faible. De même, le temps de rétention du carnosol apparait de plus en plus court avec l’augmentation du volume d’injection. Cette diminution du temps de rétention sur les composés dont le coefficient de partage est supérieur à 1 est caractéristique d’une diminution du taux de phase stationnaire. La perte de phase stationnaire observée est probablement due à l’introduction de l’échantillon en phase stationnaire, induisant un léger déséquilibre au sein de la colonne.

Le but étant de charger la colonne au maximum, une injection de 1,5 mL est préférée, correspondant à une quantité d’échantillon à injecter de 272 mg (1 mL d’échantillon comporte 181 mg de romarin dissous). La perte de phase stationnaire lors de cette injection apparait nulle.

∆V = 18,7 mL Carnosol

Chapitre 3 : Méthodologie de transfert d’échelle | 99

Figure 49 : Etude de la charge lors de l’injection de l’extrait éthanolique dissous en phase stationnaire du système solvant heptane/MTBE/éthanol/eau 4/1/4/1 (v/v) utilisé en mode ascendant. Injections de 1,0 mL à

2,5 mL, 2200 rpm, 5 mL/min, Sf = 54 %, P = 47 bar, détection UV λ = 210 nm.

Pour estimer la quantité maximale injectable à 10 mL/min, nous effectuons un transfert interne, selon la même méthodologie, à savoir ܳ_{ଵ଴௠௅Ȁ௠௜௡} ൌ  ܳ_{ହ௠௅Ȁ௠௜௡}ൈ ^{ο௏భబ೘ಽȀ೘೔೙}

ο௏_{ఱ೘ಽȀ೘೔೙}Ǥ La quantité à injecter à 10 mL/min est donc estimée à :

Qmax 10mL/min = 272 x 0,7 = 190 mg soit 1 mL d’extrait

L’injection est effectuée afin de vérifier le retour à la ligne de base entre le pic de carnosol et l’impureté précédente (Figure 50). Afin de s’assurer que cette quantité de 1 mL correspond bien à la quantité maximale injectable, un volume de 1,5 mL est également injecté. L’observation du chromatogramme montre que le retour à la ligne de base est bien respecté avant et après le pic de carnosol pour l’injection de 1 mL. En revanche, le retour à la ligne de base n’est pas observé dans le cas de l’injection d’un volume égal à 1,5 mL. Il y a donc bien surcharge dans ce cas, et donc diminution de la pureté.

2,5 mL 2,0 mL

1,5 mL

1,0 mL

Chapitre 3 : Méthodologie de transfert d’échelle | 100

Figure 50 : Injection chargée de l’extrait éthanolique dissous en phase stationnaire du système solvant heptane/MTBE/éthanol/eau 4/1/4/1 (v/v) utilisé en mode ascendant. Injection de 1,0 mL et 1,5 mL, 2200 rpm,

10 mL/min, Sf = 46 %, P = 46 bar, détection UV λ = 210 nm.

Les espaces disponibles entre les pics ∆V et la quantité maximale injectable sur le rotor analytique 35 mL ayant été déterminés à 5 mL/min et 10 mL/min, le transfert vers le rotor 254 mL peut être à présent effectué.