Transfections transitoires dans les SH-SY5Y

Afin de se rapprocher d’un modèle neuronal, les SH-SY5Y ont été utilisées à la place des HEK-293. Puisque ces cellules expriment du Tau endogène, elles ont été transfectées uniquement avec le vecteur pAAV-

U6-GFP/rz au CaCl2. Les ribozymes 350, 395 et 1467 ont été transfectés.

Le taux de transfection est suffisant pour nos expériences (cf Figure 30).

Figure 30. Photographie de la transfection des SH-SY5Y au CaCl2 post 48 heures avec le vecteur pAAV-U6-GFP/rz.

L’image de droite représente les cellules en brightfield a un grossissement 40X (microscope à fluorescence : Nikon Eclipse TE300, caméra Hamamatsu). C’est-à-dire les cellules prises avec une lumière blanche sans filtre. L’image de gauche représente les cellules prises au même grossissement sans lumière blanche avec un filtre bleu.

2.2.2. PCR et quantification

On observait (cf Figure 31) ici que le non transfecté était légèrement plus fort que le vecteur vide, on pourrait ainsi supposer qu’il

80

y avait peut-être un effet de transfection sur l’ARNm de Tau. Bien que les ribozymes 395 et 1467 ne semblaient pas diminuer l’ARNm de Tau. On observait une diminution de l’ARNm de Tau dans le cas du ribozyme 350. Ce qui pourrait laisser supposer une efficacité de ce ribozyme. Le GAPDH restait constant pour toutes les conditions.

Figure 31. Transfection des SH-SY5Y au CaCl2 avec le plasmide du ribozyme.

Les SH-SY5Y ont été transfectées au CaCl2 avec de plasmide pAAV-U6-

GFP/rz. 3 plasmides de ribozymes ont été transfectés (350, 395 et 1467). L’ARN de 3 puits de cellules a été extraits pour chaque condition et une RT-PCR a été effectuée à partir de 2μg d’ARN pour le gène de Tau et de GAPDH. Les échantillons ont migré sur gel d’agarose 1.8%. Le NT correspond au non transfecté. Le vide correspond au vecteur pAAV-U6- GFP sans ribozyme. Le contrôle positif correspond au vecteur pEGFP-C1- del-EGFP/Tau0N4R.

Lorsque l’on refaisait l’expérience dans les mêmes conditions (cf Figure 32), le vecteur vide démontrait encore une fois des résultats variables concernant l’ARNm de Tau. Le GAPDH restait constant. Cependant, on observait cette fois-ci de manière intéressante, une diminution de l’ARNm

NT Vide 350rz 395rz 1467rz Ctrl + GA PDH A RNm T au

81

de Tau en présence du ribozyme 395 dans les 3 puits plutôt qu’en présence du ribozyme 350. Le GAPDH variait aussi puisqu’il était plus faible pour ces 3 puits. Bien que l’ARNm de Tau diminuait en présence du ribozyme 395, il était difficile de conclure par simple observation du gel dans ce cas précis.

Figure 32. Transfection des SH-SY5Y au CaCl2 avec le plasmide du ribozyme.

Les SH-SY5Y ont été transfectées au CaCl2 avec de plasmide pAAV-U6-

GFP/rz. 2 plasmides de ribozymes ont été transfectés (350 et 395). L’ARN de 2 puits (NT et vide) ou de 3 puits (350 et 395) de cellules a été extrait pour chaque condition et une RT-PCR a été effectuée à partir de 2μg d’ARN pour le gène de Tau et de GAPDH. Les échantillons ont migré sur gel d’agarose 1.8%. Le NT correspond au non transfecté. Le Vide correspond au vecteur pAAV-U6-GFP sans ribozyme.

De plus, on n’observait aucun résultat significatif entre le vecteur vide et les différentes conditions lorsque l’on effectuait la quantification (cf Figure 33). Ceci pouvant être dû aux différentes variations du vecteur vide. On observait uniquement une tendance à la baisse en ce qui concernait le ribozyme 350 dans un cas, et le ribozyme 395 dans un autre cas.

NT Vide 350rz 395rz GA PDH A RNm T au

82

Figure 33. ARNm de Tau normalisé sur GAPDH en fonction des différentes conditions de transfection avec les ribozymes dans

les SH-SY5Y.

La PCR de Tau a été normalisée avec la PCR de GAPDH. Le test statistique utilisé a été un ONE-WAY ANOVA. Il n’y a pas eu de test post-hoc réalisé. Les barres d’erreur sont en SEM. L’expérience représente pour chaque condition 3 puits différents de cellules ayant subi le même traitement. L’extraction d’ARN et la RT-PCR se fait de manière indépendante.

Une transfection supplémentaire a été réalisée. En faisant un mélange du ribozyme 350 et du ribozyme 395 (ratio de 1 : 1) qui semblaient tout deux démontrer une tendance à la baisse dans les expériences précédentes. Le taux de transfection était identique aux transfections précédentes à savoir de l’ordre de 80% de cellules transfectées.

On remarquait ici (cf Figure 34) que la transfection n’avait pas d’effet sur l’ARNm de Tau puisque les cellules non transfectées et les cellules transfectées au vecteur vide présentaient une amplification équivalente. En revanche, on observait une légère diminution pour les 2 derniers puits de l’ARNm de Tau dans le cas où l’on transfectait le mélange de ribozyme. Le GAPDH restait contant pour toutes les conditions. Lorsque l’on

83

effectuait la quantification il n’y avait pas de résultat significatif (cf Figure 35).

Figure 34. Transfection des SH-SY5Y au CaCl2 avec le plasmide du ribozyme.

Les SH-SY5Y ont été transfectées au CaCl2 avec de plasmide pAAV-U6-

GFP/rz. 2 plasmides de ribozymes ont été transfectés (350 et 395) en même temps avec un ratio de 1 : 1. L’ARN de 3 puits de cellules ont été extraits pour chaque condition et une RT-PCR a été effectuée à partir de 2μg d’ARN pour le gène de Tau et de GAPDH. Les échantillons ont migré sur gel d’agarose 1.8%. Le NT correspond au non transfecté. Le Vide correspond au vecteur pAAV-U6-GFP sans ribozyme.

Figure 35. ARNm de Tau normalisé sur GAPDH en fonction des différentes conditions de transfection dans les SH-SY5Y.

La PCR de Tau a été normalisée avec la PCR de GAPDH. Le test statistique utilisé a été un ONE-WAY ANOVA. Il n’y a pas eu de test post-hoc réalisé.

Mix RZ Vide NT A RNm T au GA PDH

84

Les barres d’erreur sont en SEM. L’expérience représente pour chaque condition 3 puits différents de cellule ayant subi le même traitement. L’extraction d’ARN et la RT-PCR se fait de manière indépendante.

L’objectif 2 a permis d’identifier les ribozymes les plus efficaces parmi la liste de 5 candidats présélectionnés en essai in vitro. Bien que tous les résultats demeurent non significatifs, la transfection dans les HEK293 a démontré une tendance à la baisse de l’ARNm de Tau en présence du ribozyme 395, tandis que la transfection dans les SH-SY5Y a démontré une tendance à la baisse de l’ARNm de Tau en présence du ribozyme 350 dans un cas et 395 dans un autre cas.

De plus, la transfection d’un mélange de ribozyme (350 et 395) a démontré une légère diminution de l’ARNm de Tau.

III. Objectif 3 : Valider et caractériser l’efficacité du