Contexte cellulaire

Les 1ères cellules utilisées afin de tester notre ribozyme ont été les HEK- 293. Ces cellules sont particulièrement faciles à transfecter bien qu’elles possèdent très peu de Tau endogène. La difficulté de cette cotransfection se trouvait dans le dosage du plasmide de Tau par rapport au plasmide du ribozyme. Étant donné que Tau a été surexprimé dans la cellule, nous avions décidé de transfecter le plasmide du ribozyme en excès par rapport au plasmide de Tau. 2 ratios ont été testées, tous deux ont démontré une diminution de l’ARNm de Tau en présence du ribozyme 395. La diminution de l’ARNm de Tau dans le cas du ratio 1 : 5 semblait plus forte que la diminution de l’ARNm de Tau dans le cas du ratio 1 : 10. Bien que le vecteur vide ne pût pas réellement opérer comme contrôle dans le cas du ratio 1 : 5 (étant donné une réduction de l’ARNm de Tau en présence du vecteur vide), cette diminution fut surprenante. On s’attendrait à une diminution plus importante pour le ratio 1 : 10 que pour le ratio 1 : 5, puisqu’il y aurait plus de ribozyme. Pour expliquer cela, on pourrait supposer ici que le ribozyme suit une courbe de cinétique enzymatique exponentielle de Michaelis-Menten. En effet, dans le ratio 1 : 5, 1600ng de plasmide de ribozyme a été transfecté ; et dans le ratio 1 : 10 c’est 1800ng de plasmide de ribozyme qui a été transfecté. Ainsi la différence est négligeable. On peut supposer que c’est la même quantité d’enzyme qui a été transfecté. Cependant, pour le substrat (ici l’ARNm de Tau), ou c’est 200ng de plasmide de Tau qui a été transfecté dans un cas (ratio 1 : 5) pour 400ng de plasmide de Tau dans l’autre cas (ratio 1 : 10), la

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différence est plus remarquable. Le substrat a été doublé d’un ratio à l’autre. Ainsi, si on suppose que la concentration de l’enzyme reste identique et la concentration du substrat double, on peut analyser la vitesse de l’enzyme selon une courbe Michaelis-Menten. Plus il y aura de substrat et plus l’enzyme sera efficace jusqu’à atteindre sa vitesse maximale (Johnson & Goody, 2011). Dans notre cas précis, il y a plus de substrat dans la condition du ratio 1 : 5, ainsi l’enzyme serait plus rapide et plus efficace dans cette condition. Ceci pourrait expliquer la différence de diminution de l’ARNm de Tau entre les deux ratios. Il serait possible dans le futur d’effectuer une analyse de la cinétique enzymatique du ribozyme afin d’avoir plus de détails sur le mécanisme de fonctionnement du ribozyme.

Pourtant, cette méthode de cotransfection n’est pas forcément idéale puisque d’une transfection à l’autre, le plasmide de Tau peut être plus ou moins exprimé. Ce qui est d’ailleurs peut être le cas pour le ratio 1 : 5 avec le premier puit du vecteur vide où le GAPDH reste contant mais l’ARNm de Tau est diminué. Dans toutes ces expériences de cotransfection le taux de transfection nous indique simplement à chaque fois que le plasmide pAAV-U6-GFP/rz est bien rentré dans la cellule, et la PCR nous informe sur l’expression du plasmide pEGFP-C1-del-GFP. Il serait nécessaire une fois de plus d’effectuer une PCR pour le ribozyme afin de vérifier son expression. Le point positif pour les cotransfections dans les HEK293 est que le résultat concernant le ribozyme 395 est reproductible d’un ratio à un autre.

Les cellules SH-SY5Y ont été un bon modèle cellulaire puisque ce sontdes

cellules de type neuronal. Malgré le fait qu’elles soient plus difficiles à transfecter, elles possèdent du Tau endogène ce qui permet d’éviter le

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biais de la surexpression et de se rapprocher d’un modèle plus physiologique. Le problème rencontré pour ces transfections a été l’effet de la transfection sur l’ARNm de Tau. On observait presque toujours une différence entre l’ARNm de Tau dans les cellules non transfectées et dans les cellules transfectées avec le vecteur vide. Ceci peut s’expliquer par le fait que la technique de CaCl2 est plus toxique pour les cellules que la

technique de Jet Prime®. Les cellules sont alors plus fragilisées. Cet effet de transfection n’est néanmoins pas toujours observé puisque la transfection faite avec le vecteur vide et le mélange de ribozyme ne démontre pas cela. Aussi, il est à noter que le passage des cellules peut influencer leur fragilité. Plus les cellules sont vieilles, plus celles-ci sont sensibles à la mortalité.

D’autre part, les transfections dans les SH-SY5Y ont démontré des résultats intéressants concernant le ribozyme 350 et le ribozyme 395. D’une expérience à l’autre, les résultats ont été variables. Cependant, on observe dans un cas une diminution de l’ARNm de Tau en présence du ribozyme 350, et dans l’autre une diminution de l’ARNm de Tau en présence du ribozyme 395. Ces deux résultats ne démontrent pas de différence significative par rapport au vecteur vide, mais démontrent tout de même une forte tendance à la baisse.

Lorsque mélangés, ces deux ribozymes montrent encore une fois une tendance à la baisse, non significative, par rapport au vecteur vide. Afin d’améliorer cette expérience de transfection, il serait possible d’augmenter le temps d’incubation des cellules, passer de 48h à 72h. Cependant, la difficulté réside dans la mortalité cellulaire, puisqu’après 48h les cellules sont confluentes à 100%, il est possible que les cellules les plus fragiles (celles qui ont intégrés le plasmide par exemple) se décollent plus facilement. Néanmoins, le ribozyme aurait plus de temps pour effectuer la coupure de l’ARNm de Tau, les résultats pourraient ainsi être plus probants. Aussi, une autre méthode pour améliorer les résultats

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seraient d’effectuer une lignée stable de SH-SY5Y avec le plasmide du ribozyme.