Toxicité des intermédiaires réactionnels

L’objectif est de savoir si l’effet toxique de l’hydrochlorure de tétracycline est éliminé au cours du traitement par photocatalyse. Pour cela, la toxicité des intermédiaires réactionnels formés lors de la dégradation photocatalytique est examinée et comparée à celle de l’hydrochlorure de tétracycline. Cette toxicité est examinée en utilisant respectivement la biomasse utilisée pour le test de Sturm et une culture de Pseudomonas aeruginosa.

123 III.2.1 Toxicité sur la biomasse

Dans le test de Sturm réalisé sur les intermédiaires de la réaction de dégradation photocatalytique de l’hydrochlorure de tétracycline, il n’y a pas eu production de CO2 due à la

biodégradation. La conclusion établie est que les intermédiaires ne sont pas biodégradables. Une des explications à l’absence de biodégradation peut être un effet toxique des intermédiaires ou de la TC sur la biomasse. Pour vérifier cette hypothèse, il a été évalué si à la fin du test de Sturm, la biomasse présentait encore une activité de biodégradation. Pour cela, le benzoate de sodium a été utilisé comme composé à biodégrader par la biomasse utilisée dans le test de Sturm.

A l’issu du test de Sturm, 100 mL de solution de benzoate de sodium à 400 mg/L en COD sont ajoutés dans les réacteurs 1, 2, 3 et 4 pour déterminer si la biomasse peut encore avoir une activité de biodégradation. Les solutions constituant le milieu de Sturm sont rajoutées dans tous les réacteurs et pour avoir un même volume dans les réacteurs, 100 mL d’eau distillée sont ajoutés dans les réacteurs 5 et 6. Les dosages et le changement des pièges sont effectués comme décrit dans la partie expérimentale du test de Sturm (chapitre II).

III.2.1.1 Résultats du test de toxicité sur la biomasse

La quantité de CO2 formé dans les réacteurs et les pourcentages de biodégradation

correspondant sont donnés dans le Tableau III. 4. Dans les réacteurs 2 et 3 qui contiennent les intermédiaires de la TC, le benzoate de sodium est minéralisé à 64 et 56 % et dans le réacteur 1 qui contient la tétracycline, il est minéralisé à 90 %. Le pourcentage de biodégradation du benzoate au bout de 15 jours dans le test de Sturm était de 63 % (paragraphe III.1.2). Ce pourcentage de biodégradation est comparable à celui obtenu dans le test de toxicité sur la biomasse excepté pour le pourcentage dans le réacteur 1 (90%). La valeur élevée de 90 % peut être attribué à un co-métabolisme. La présence de la tétracycline ou de ses intermédiaires réactionnels n’a donc a priori pas d’effet sur l’activité de biodégradation de la biomasse. En effet, le benzoate de sodium rajouté dans les réacteurs contenant la TC et ses intermédiaires a été biodégradé. En conclusion, la tétracycline et ses intermédiaires réactionnels ne présentent pas d’effet toxique pour la biomasse utilisée dans le test de Sturm.

124 Tableau III. 4 : Masse de CO2 produite dans chaque réacteur à la fin du test de toxicité (15

jours) et % de biodégradation du benzoate de sodium (BS) correspondant Réacteurs

1 2 3 4 5 6

CO2 (mg) 157 113 104 118 6.8 13,1

% de biodégradation du BS 90 64 54 76 - -

BS : benzoate de sodium

III.2.2 Effet sur l’activité enzymatique des bactéries de type P. aeruginosa

L’utilisation des bactéries P. aeruginosa en tant qu’indicateur de la toxicité des composés a été présentée au chapitre II. Dans ce travail les bactéries P. aeruginosa sont utilisées pour évaluer la toxicité des intermédiaires réactionnels de l’hydrochlorure de tétracycline en comparaison à l’effet toxique avant le traitement photocatalytique.

III.2.2.1 Incubation

L’effet des intermédiaires de la TC sur des cellues de P. aeruginosa est évalué en mettant en contact une suspension de P. aeruginosa et les échantillons prélevés au cours du traitement photocatalytique dans des tubes à hémolyse placés à 30°C. Les volumes mis en contact dans les tubes à hémolyse sont de 3 mL pour la suspension de P. aeruginosa, de 0,5 mL pour les échantillons et la durée d’exposition est de 19 heures. Les P. aeruginosa sont également exposées à une solution ne contenant que la TC afin d’évaluer l’effet toxique de la TC puis le comparer à celui des intermédiaires.

III.2.2.2 Mesure de l’activité enzymatique

Après exposition des bactéries P. aeruginosa aux échantillons traités et à la solution de TC, le volume dans chaque tube à hémolyse est ajusté à 6 mL avec une solution tampon, solution de trishydroxyméthylaminométhane (TRIS, 0,1 M) à pH 8,4, puis 1 mL de solution de chlorure de 2-(4-iodophényl)-3-(4-nitrophényl)-5-phényltétrazolium (INT, 2 g/L) est ajouté dans les tubes. Une solution dite « blanc » est préparée. Elle contient 3 mL de suspension de

P. aeruginosa et 6 mL de solution tampon TRIS. D’autres solutions dites « témoins positifs »

sont préparées (duplicata), elles contiennent la suspension de P. aeruginosa, le tampon TRIS et l’INT. Les solutions « témoins positifs » servent à estimer l’activité déshydrogénase des bactéries P. aeruginosa avant contact avec les échantillons de la solution de TC traitée et la solution de TC. Les proportions de chaque constituant des tubes au cours du test sont

125 présentées dans le Tableau III. 5.

Tableau III. 5 : Réalisation du test sur la mesure de l’effet de la TC et de ses sous-produits sur l’activité enzymatique des bactéries Pseudomonas aeruginosa

Blanc Témoin positif

Durée d’irradiation du traitement photocatalytique (min) 0 0 10 30 60 80 100 Suspension de bactérie (mL) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Solution traitée (mL) - - - 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 TRIS (mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 INT (mL) - 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ED (mL) 1,5 0,5 0,5 - - - -

INT : chlorure de 2-(4-iodophényl)-3-(4-nitrophényl)-5-phényltétrazolium, TRIS : trishydroxyméthylaminométhane, ED : eau déminéralisée

Une fois l’INT ajouté dans les solutions, les mélanges sont laissés pendant 30 minutes à 30°C, puis dans chaque tube, 8 mL de méthanol sont ajoutés afin d’extraire le formazan formé. Dix minutes plus tard ces solutions sont centrifugées à 1000 tr/min. Les surnageants sont récupérés et les absorbances sont lues à 480 nm avec comme référence le blanc préparé précédemment.

III.2.2.3 Résultats du test de toxicité sur l’activité enzymatique des bactéries P.

aeruginosa

La Figure III. 3 montre l’évolution de la formation du formazan dans chaque échantillon traité en fonction de la concentration résiduelle en Tétracycline dans la solution. La moyenne de formazan obtenue dans les témoins positifs est de 51 µmol/L. En présence d'une solution d’hydrochlorure de tétracycline seulement, la concentration en formazan est d’environ 32 µmol/L, ce qui correspond à une diminution de 40% par rapport à la concentration obtenue dans le témoin positif. Cette diminution de la production de formazan est attribuée à une perturbation du métabolisme bactérien. La tétracycline présente en solution agit sur l'activité déshydrogénase des bactéries P. aeruginosa, moins d'électrons circulent alors dans la chaîne respiratoire et moins de formazan se forme. Lorsque la concentration en

126 tétracycline diminue, plus de formazan se forme. Après 80 minutes de traitement photocatalytique, 93 % de tétracycline est dégradé ([TC] <5 mg/L) et seulement 24% du COD initial est minéralisé relativement à la présence de composés organiques encore en solution. Cependant, en comparaison avec le début du traitement photocatalytique ([TC] = 70 mg/L), la concentration en formazan a augmenté. Ce résultat suggère qu’en comparaison à la tétracycline, les intermédiaires formés au cours de la photocatalyse sont moins toxiques pour les bactéries P. aeruginosa.

Figure III. 3 : Effet de la tétracycline et de ses intermédiaires sur l’activité déshydrogénase des bactéries P. aeruginosa

III.2.3 Résultats et discussion sur l’étude de la toxicité des intermédiaires réactionnels Les effets toxiques de la TC et de ses intermédiaires ont été examinés en utilisant respectivement la biomasse d’une station d’épuration et une culture de P. aeruginosa. Les résultats obtenus sur l’étude de la toxicité sur la biomasse ont montré que la TC et ses intermédiaires n’avaient pas d’effet sur l’activité de biodégradation de la biomasse. Les résultats du test sur l’étude de l’effet sur l’activité déshydrogénase des bactéries P. aeruginosa ont montré que les intermédiaires avaient un effet moins toxique sur les bactéries P.

aeruginosa que la tétracycline elle-même.

Des résultats similaires sur la baisse de la toxicité lors du traitement par photocatalyse ont été trouvés par Reyes et ses co-auteurs (Reyes et al., 2006). A contrario, les résultats de cette présente étude diffèrent de ceux trouvés par Jiao et ses co-auteurs et López-Peñalver et co-auteurs (Jiao et al., 2008a, Jiao et al., 2008b, López-Peñalver et al., 2010). Au vu de ces différents résultats sur la toxicité, il en ressort que :

25 30 35 40 45 50 55 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Co n ce n tr a ti o n e n f o rm a za n ( µ m o l/ L ) Concentration en tétracycline (mg/L) COD = 0 mg/L Pas d’effet toxique

effet toxique, solution pure de TC

Diminution de l’effet toxique

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i) la toxicité des intermédiaires réactionnels dépend du procédé d'oxydation. En effet d’un

procédé à l’autre, les mécanismes réactionnels diffèrent, la nature des intermédiaires peut également différer et comme l’effet dépend du composé auquel l’organisme est exposé, la toxicité dépend du procédé d’oxydation.

ii) la toxicité des intermédiaires dépend des organismes utilisés (P. aeruginosa, vibrio

fischeri, Daphnies etc.) pour le test de toxicité.

III.3. Conclusion sur l’étude de l’impact environnemental des intermédiaires

Lors du traitement de l’hydrochlorure de tétracycline par photocatalyse, des intermédiaires réactionnels sont formés. L’impact environnemental de ces intermédiaires réactionnels a été évalué en terme de biodégradabilité par le test de Sturm et en terme de toxicité sur d’une part, une culture de P. aeruginosa et d’autre part, sur la biomasse d’une station d’épuration.

Les résultats concernant la toxicité ont montré que la TC et ses intermédiaires n’avaient pas d’effet toxique sur la biomasse et que les intermédiaires réactionnels présentaient une plus faible toxicité sur les P. aeruginosa que l’hydrochlorure de tétracycline elle-même. Aussi il est possible de dire que le traitement photocatalytique, dans les conditions expérimentales utilisées dans cette étude, a permis de réduire la toxicité initiale de la solution.

Les résultats du test de Sturm ont montré que les intermédiaires réactionnels étaient aussi peu biodégradables que l’hydrochlorure de tétracycline. Les travaux menés par Arslan- Alaton et al., (2004) et par Reyes et al., (2006) ont montré que le traitement des composés peu biodégradables par des procédés d’oxydation (UV/H2O2, ozonation, photocatalyse etc…) peut

augmenter la biodégradabilité ; les produits issus de l’oxydation sont plus oxydés que les produits initiaux et plus biodégradables. Néanmoins dans les conditions expérimentales de cette présente étude, les résultats n’ont pas conduit à la même conclusion. Ainsi en considérant ce résultat, il a semblait judicieux d’orienter les recherches vers l’étude de la structure des intermédiaires réactionnels.