Chapitre 2. Résultats
2.1 Optimisation des rétrovirus SIN
2.1.1 Titres viraux des productions transitoires des vecteurs rétroviraux GFP
Les rétrovirus ont été choisis comme vecteur pour livrer l'ADNc de COL7A1, car ils peuvent s’intégrer de manière stable dans le génome des cellules permettant une expression à long terme du transgène. Les lentivirus peuvent également s'intégrer dans le génome, mais n'ont pas été sélectionnés dus à leurs effets cytotoxiques restreignant une expression constitutive dans les cellules d’encapsidation (175). Les adénovirus sont maintenus dans la cellule sous forme épisomale et puisque le vecteur est perdu dans 2 % des divisions cellulaires, ce type de vecteur n'a pas été retenu, car il ne favorise pas naturellement une expression à long terme du transgène (258). Les AAV ont été exclus, car la taille du génome pouvant être encapsidée d'environ 4,7 kpb est inférieure à la taille de l'ADNc de COL7A1 de 8,8 kpb (55, 259). De plus, les AAV sont aussi retrouvés sous forme épisomale et ne s'intègrent dans le génome que dans environ 10 % des cas, et cette dernière forme n'est pas la source primaire d'expression du transgène, rendant ce type de vecteur non- optimal pour une expression à long terme de gènes (260).
Divers plasmides codants pour des rétrovirus SIN ont été produits (Tableau 2). Les rétrovirus SIN ont été choisis pour la thérapie génique chez l’humain, car ceux-ci sont plus sécuritaires comparativement aux rétrovirus qui expriment le transgène sous contrôle des LTRs, car ces derniers sont capables d'activer des proto-oncogènes à proximité de leur site d’intégration (215-217). Parmi ces plasmides, il y a deux grandes catégories: ceux codant pour la GFP et ceux codant pour le COLVII. L’optimisation du rétrovirus a débuté par une délétion de 379 pb dans la région U3 du LTR 3’ du plasmide codant pour GFP (KG). Chez les rétrovirus SIN, comme les enhancers et promoteurs viraux sont supprimés, l’expression du transgène par le provirus nécessite un promoteur interne (222). Le promoteur EF1-α a été choisi, car il est de petite taille (237 pb) (et l'ADNc de COL7A1 fait 8,8 kpb et est supérieur à la taille de l'ARNg du MLV de 8,3 kpb ce qui peut nuire à l'encapsidation du vecteur), il permet une expression en continu du gène thérapeutique et est actif dans divers types
cellulaires (55, 58, 176, 261-265). EF1-α a donc été cloné comme promoteur interne dans le vecteur SIN (KG).
Tableau 2. Plasmides codants pour les vecteurs rétroviraux SIN.
Lors de la formation de particules virales infectieuses, le niveau d'expression de l’ARNg dans les cellules d’encapsidation peut être un facteur limitant (266). Cela peut être influencé, dépendamment de la lignée des cellules d’encapsidation, par une compétition entre le promoteur du LTR 5’ et le promoteur interne ce qui réduit la production de transcrits de pleines tailles dû à l’occupation du promoteur interne par des facteurs de transcription (267, 268). De plus, il a été rapporté que les délétions dans la région U3 du LTR 3' des γ-rétrovirus réduisent les titres viraux et que le remplacement de la région U3 du LTR 5’ par d'autres promoteurs peut augmenter les titres viraux (178, 227, 269). Ainsi, afin de trouver le promoteur permettant la plus forte expression du génome viral, l'enhancer et le promoteur du CMV, du RSV et le promoteur CAG ont été testés dans la région U3 du LTR 5’. Trois rétrovirus différents encodés par les plasmides pSIN.CMV-GFP, pSIN.RSV-GFP et pSIN.CAG-GFP ont été générés (Figure 8) (KG) (251, 267, 269, 270). Le promoteur du CMV a été choisi, car chez le SNV (acronyme de la terminologie anglaise pour Spleen
Necrosis Virus; virus de la nécrose de la rate), ce promoteur a été remplacé dans un vecteur SIN au
niveau du LTR 5’ et a permis d’obtenir des titres viraux similaires à ceux du vecteur sauvage (269). Le promoteur RSV a été choisi, car son utilisation chez les γ-rétrovirus SIN a permis d’augmenter les titres viraux de quatre fois comparativement au vecteur parental SIN (267). Le promoteur synthétique CAG a été choisi, car il s'est montré 1,6 fois supérieur au promoteur CMV et 11,6 fois supérieur au promoteur RSV dans quatre lignées cellulaires différentes (L, F9, CHO et HepG2) selon le niveau d'activité enzymatique de la β-galactosidase exprimée par ces promoteurs (270). Ce promoteur est composé de l’enhancer (amplificateur) du CMV (C), du promoteur de la β-actine de poulet (A) suivi
de son premier exon non codant, son premier intron et des 5 premières paires de bases de son deuxième exon (270-272). Le site accepteur d'épissage dans le premier intron du promoteur CAG a été remplacé par celui situé entre le 2e intron et le 3e exon du gène de β-globine de lapin (G) (273).
La séquence codante de gfp a été utilisée comme gène rapporteur afin de faciliter l'identification des cellules transduites. La production transitoire de vecteurs viraux a d’abord été effectuée, car elle permet de rapidement obtenir des vecteurs viraux et d’obtenir des résultats préliminaires. Le PEI a été utilisé, car il est efficace pour la transfection et est couramment utilisé dans notre laboratoire. L’enveloppe VSV-G a été utilisée pour pseudotyper (remplacer l'enveloppe virale) les particules rétrovirales afin d’augmenter leur efficacité de transduction, car elle permet d'obtenir des titres viraux élevés avec les productions transitoires ce qui permet de mieux discerner le potentiel des clones (274). Les rétrovirus SIN.CMV-GFP, SIN.RSV-GFP et SIN.CAG-GFP pseudotypés avec l’enveloppe VSV-G ont généré des titres viraux de 8,4 x 105, 1,5 x 105 et 4,8 x 105 particules virales infectieuses
(Unités Infectieuses; UI) par mL respectivement tandis que le rétrovirus MFG-GFP a produit un titre viral de 1,0 x 106 UI/mL (Figure 9) (KG). Les rétrovirus SIN ont donc généré des titres viraux
inférieurs au rétrovirus MFG. Le promoteur CMV s'est montré plus efficace pour augmenter le titre viral du rétrovirus SIN GFP que les promoteurs CAG et RSV avec les productions transitoires issues des cellules 293T. RSV était le promoteur le moins efficace parmi les trois testé pour exprimer la GFP avec le rétrovirus SIN. Le promoteur du CMV a donc été conservé pour la suite de l’optimisation du rétrovirus SIN.
Figure 8. Plan de conception des rétrovirus SIN. Les plasmides pSIN.CMV-GFP, pSIN.RSV-GFP,
pSIN.CAG-GFP, pSIN.CMV-GFP-WPRE, pSIN.CMV-GFP-WPRE.SV40, pSIN.CMV-GFP-WPRE.SV40-BGH, pSIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH, pSIN.CMV-COL7A1-WPRE.SV40-BGH et pSIN.CMV-COL7A1.SV40- BGH.TK-BSD ont été construits selon ce plan. Seul le plasmide pSIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH.TK-BSD contient la cassette de sélection TK-BSD-SV40.
Il a été montré que des délétions dans la région U3 du LTR 3' des rétrovirus sont associées à un défaut de transport de l’ARN viral du noyau vers le cytoplasme dû à une séquence agissant en cis présente dans cette région qui est nécessaire pour l’exportation (178). Or, l’incorporation de la séquence WPRE dans la région 3’ UTR du transgène permettrait d’augmenter l’exportation de l’ARNm du noyau et de stabiliser les transcrits augmentant ainsi la quantité de protéines produites de cinq à huit fois et le titre viral (275-277). De plus, la séquence WPRE agirait aussi comme terminateur de la transcription et son inclusion dans le vecteur SIN pourrait améliorer la terminaison de la transcription qui est reconnue pour être déficiente chez les rétrovirus SIN (227, 229, 278). La séquence WPRE a donc été insérée dans la région 3’ UTR l'ADNc de gfp chez pSIN.CMV-GFP ce qui a généré pSIN.CMV-GFP-WPRE (KG). Le rétrovirus SIN.CMV-GFP-WPRE a généré un titre viral de 2,1 x 106 UI/mL qui est deux fois et demi plus élevés que celui de SIN.CMV-GFP de 8,4 x 105
UI/mL (KG) (Figure 9). L'ajout de la séquence WPRE au vecteur SIN.CMV-GFP a donc permis d’augmenter le titre viral de SIN.CMV-GFP.WPRE produit de manière transitoire dans les cellules 293T et a été conservée pour la suite de l’optimisation du rétrovirus SIN.
Figure 9. Analyse des titres viraux des vecteurs rétroviraux SIN exprimant GFP par cytométrie en flux.
Transduction de cellules HT-1080 avec MFG-GFP, SIN.RSV-GFP, SIN.CAG-GFP, SIN.CMV-GFP, SIN.CMV- GFP-WPRE, SIN.CMV-GFP-WPRE.SV40, SIN.CMV-GFP-WPRE.SV40-BGH pseudotypés avec l’enveloppe VSV-G produits par production transitoire. Les valeurs présentées sont la moyenne ± l'écart type de trois réplicats biologiques. UI, unités infectieuses.
Il a été montré que la délétion de séquences dans la région U3 des γ-rétrovirus corrèle avec des défauts dans la modification de l’extrémité 3’ de l’ARNg se traduisant par une terminaison de la transcription moins efficace, ce qui augmente la probabilité de lecture à travers les gènes cellulaires en aval du site d'intégration du provirus (227, 229). Dans les cellules d'encapsidation, ceci pourrait mener à l’incorporation de proto-oncogènes dans le génome du vecteur et réduit les titres viraux de plus de dix fois (178, 226, 228). Or, il a été montré que l’ajout de la totalité de la séquence de polyadénylation du SV40 à la fin de la région U5 du LTR 3’ d’un rétrovirus SIN permettait d’améliorer l’efficacité de terminaison et d’augmenter le titre viral de trois logarithmes, bien que le titre viral soit resté cinq fois moindre que celui du rétrovirus sauvage (227). Ainsi, la séquence de polyadénylation du SV40 a été insérée dans la région R du LTR 3' de pSIN.CMV-GFP-WPRE dans le but d'augmenter l'efficacité de terminaison de la transcription, ce qui a généré pSIN.CMV-GFP- WPRE.SV40 (KG). SIN.CMV-GFP-WPRE.SV40 pseudotypé de l’enveloppe VSV-G a produit un titre viral de 3,0 x 106 UI/mL (KG) (Figure 9). L’incorporation de la séquence de polyadénylation du SV40
dans la région R du LTR 3' n'améliore pas de façon significative le titre viral du rétrovirus SIN.CMV- GFP-WPRE produit de manière transitoire dans les cellules 293T, mais augmente le titre viral maximum de SIN.CMV-GFP-WPRE.SV40. Ainsi la séquence de polyadénylation du SV40 a été conservée dans le vecteur SIN pour la suite de l’optimisation.
Il a été montré qu’un MLV SIN doté du promoteur du CMV dans la région U3 du LTR 5’ et contenant trois séquences de polyadénylation du SV40 en aval de la région R du LTR 3’ permettait d’augmenter le titre viral de deux à trois logarithmes et l’expression du transgène de quatre fois comparativement au rétrovirus parental avec des LTRs intacts (183). D’autre part, la transfection dans des cellules animales d’un plasmide exprimant bGH suivi de sa région de polyadénylation a montré que l’efficacité de terminaison était similaire à celle de SV40 (279). Une autre étude a montré qu’un plasmide contenant un transgène suivi de la région de polyadénylation de bGH générait une expression trois fois plus élevée que le même plasmide, mais contenant plutôt la séquence de polyadénylation du SV40 comme terminateur (280). Ainsi, la séquence de polyadénylation de bGH a été ajoutée 40 pb en aval du LTR 3’ de pSIN.CMV-GFP-WPRE.SV40 ce qui a généré pSIN.CMV- GFP-WPRE.SV40-BGH (KG). Le rétrovirus encodé par ce plasmide et pseudotypé de l’enveloppe VSV-G a généré un titre viral de 3,2 x 106 UI/mL (KG) (Figure 9). La séquence de polyadénylation
supplémentaire en aval du LTR 3’, celle de bGH, a augmenté le titre viral de SIN.CMV-GFP- WPRE.SV40-BGH généré par production transitoire avec les cellules 293T.
En somme, le remplacement du promoteur dans la région U3 du LTR 5' par l'enhancer et le promoteur du CMV, l'ajout de la séquence WPRE en 3' UTR de gfp, l'insertion de la séquence de polyadénylation de SV40 dans la région R du LTR 3' et l'ajout de la séquence de polyadénylation de
bGH en aval du LTR 3' a augmenté de manière significative le titre viral du vecteur SIN.CMV-GFP-
WPRE.SV40-BGH comparativement à MFG-GFP (Figure 9).