1.1 Construction des plasmides
Les vecteurs rétroviraux construits sont listés au tableau 2 et leur construction est schématisée à la Figure 8. Les vecteurs rétroviraux ont été construits à partir de pMFG (250). La séquence codante de gfp BamHI de 721 pb provenant de pRRLGFP (251) a été clonée dans le site de clonage multiple de pMFG ce qui a généré pMFG-GFP. La région U3 du LTR 3’ de pMFG-GFP a eue une délétion de 379 pb NheI/SacI ce qui a généré pSIN-GFP. La région U3 du LTR 5’ de pSIN.GFP a été remplacée par l'enhancer et le promoteur du CMV (Cytomégalovirus) HindIII/SacI de 523 pb, du RSV (acronyme de la terminologie anglaise pour Rous Sarcoma Virus; virus du sarcome de Rous) HindIII/SacI de 232 pb ou du promoteur CAG (Promoteur synthétique: CMV, β-Actine, β- Globine) HindIII/SacI de 644 pb extraits de pCMVbeta (Clontech), pRRLGFP et pCAGΔ829-EGFP ce qui a généré pSIN.CMV-GFP, pSIN.RSV-GFP et pSIN.CAG-GFP respectivement (251, 252). Le promoteur EF1-α ApaI/BamHI de 245 pb a été cloné en aval de la séquence de gfp dans pSIN.CMV- GFP, pSIN.RSV-GFP et pSIN.CAG-GFP. La séquence WPRE SmaI/EcoRV de 611 pb provenant de pRRL a été clonée dans pSIN.CMV-GFP ce qui a généré pSIN.CMV-GFP-WPRE. La séquence de polyadénylation du SV40 SmaI de 222 pb provenant de pCI Mammalian Expression Vector (Promega) a été insérée dans la région R du LTR 3’ de pSIN.CMV-GFP-WPRE ce qui a généré pSIN.CMV-GFP-WPRE.SV40. La séquence de polyadénylation de bGH (acronyme de la terminologie anglaise pour Bovine Growth Hormone; hormone de croissance bovine) AflII de 225 pb a été clonée 44 pb en aval du LTR 3’ dans pSIN.CMV-GFP-WPRE.SV40 ce qui a généré pSIN.CMV- GFP-WPRE.SV40-BGH.
La séquence codante de gfp BamHI de 721 pb a été retirée de pSIN.CMV-GFP- WPRE.SV40.BGH et celle de COL7A1-opt. BamHI de 8835 pb (GenScript) y a été clonée ce qui a généré pSIN.CMV-COL7A1-WPRE.SV40-BGH. pSIN.CMV-GFP-WPRE.SV40-BGH a été ouvert avec EcoRV et un insert BamHI a été ajouté. Ce plasmide a été digéré avec BamHI ce qui a permis de retirer la séquence gfp et WPRE puis COL7A1-opt. BamHI de 8835 pb y a été clonée, ce qui a généré pSIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH. La cassette de sélection TK-BSD-SV40 (promoteur thymidine kinase du virus herpès simplex de type 1, Blasticidine S Déaminase) BamHI de 709 pb
provenant de Genscript a été clonée dans pSIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH ouvert en BglII ce qui a généré pSIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH.TK-BSD.
1.2 Transformation
La souche d’Escherichia coli XL1-Blue (Stratagene) a été transformée avec les plasmides pSIN.CMV-GFP-WPRE, pSIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH et pSIN.CMV-COL7A1-WPRE.SV40-BGH par électroporation (BIO-RAD). Les cellules ont ensuite été étalées sur milieu LB (GIBCO-BRL) additionné de 50 µg/mL d’ampiciline (GIBCO-BRL). Les extractions d’ADNp ont été effectuées avec les réactifs de la compagnie QIAGEN et Geneaid.
1.3 Culture cellulaire
Les cellules 293Vec-Ampho (293GP-A2) et 293Vec-RD114 (293GP-R30) générées par Karim Ghani (KG) sont dérivées des HEK293 (ATCC CRL-1573) (249). Ces cellules contiennent de façon stable les gènes gag et pro-pol du Mo-MLV et l’enveloppe ampho 4070A ou RD114 (Enveloppe de virus endogène de chat) respectivement (249, 253). Les cellules 293T (ATCC CRL- 3216), 293Vec-Ampho, 293Vec-RD114, MNNG/HOS (ATCC CRL-1547), 143B (ATCC CRL-8303), MCF7 (ATCC HTB-22), TE671 (ATCC CRL-8805), HeLa (ATCC CCL-2), MG-63 (ATCC CRL-1427) et HT-1080 (ATCC CCL-121) ont été cultivées en présence de DMEM (acronyme de la terminologie anglaise pour Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium; milieu minimum essentiel de Eagle) (Wisent) contenant 10 % sérum bovin fœtal (Life Technologies) et 1 % de pénicilline/streptomycine. Lors des passages, le nombre de cellules a été analysé avec un hématimètre.
Les kératinocytes et fibroblastes humains ont été obtenus d’une biopsie de peau d’une patiente adulte atteinte de l'EBDR ayant signé un formulaire de consentement éclairé. Les kératinocytes et fibroblastes ont été isolés par la méthode à deux étapes de thermolysine et de trypsine, amplifiés et cryopréservés au passage 4 (233, 254). Les kératinocytes ont été co-cultivées avec une couche de cellules nourricières humaines irradiées une fois à 7000 centiGray (cGY): les iHFL2 (irradiated Human Fibroblasts Layer-2) (255, 256). Les iHFL2 ont été ensemencées au moins
flacons de culture cellulaire T75 (Corning) et plaques 12 puits (Corning) respectivement et ont été gardés en culture au maximum un mois. Les kératinocytes ont été cultivés dans du DMEM 3:1 avec du Ham’s Nutrient Mixture F12 media (Life Technologies) supplémenté de 5 % FetalCloneII (HyCLone), 5 µg/mL d’insuline (Sigma-Aldrich), 0,4 µg/mL d’hydrocortisone (Calbiochem), 212 ng/mL de chlorydrate-2-isopréténol (Sandoz), 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique humain (Austral Biologicals), 100 IU/mL de péniciline G et 25 µg/mL de gentamicine (Sigma-Aldrich). Le milieu de culture des kératinocytes a été changé une fois par semaine. Les fibroblastes ont été cultivés dans du DMEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal (Wisent), 100 IU/mL de péniciline G et 25 µg/mL de gentamicine. Le milieu de culture a été changé tous les 2 jours. Lors des passages, le nombre de cellules et leur taille moyenne ont été analysés avec un appareil Coulter (Beckman Coulter).
1.4 Production de virus par transfection transitoire
Tous les plasmides codants pour un rétrovirus portant gfp ainsi que pSIN.CMV- COL7A1.SV40-BGH.TK-BSD et pSIN.CMV-COL7A1-WPRE.SV40-BGH.TK-BSD ont été transfectés de façon transitoire dans les 293T sous-confluentes. Les cellules 293T ont été ensemencées à raison de 1 x 106 cellules par puits dans des plaques 6 puits (SARSTEDT), avec 1 mL de milieu de
culture. Seize heures plus tard, 0,5 µg de pMD2.GPiZeo codant pour gag et pro-pol (249), 0,5 µg de pMD2.G codant pour l’enveloppe VSV-G (acronyme de la terminologie anglaise pour Vesicular
Somatitis Virus G protein; protéine G du virus de la stomatite vésiculaire) fourni par le Dr. Didier
Trono, 1 µg de plasmides rétroviraux et 4 µg de PEI ont été utilisés pour chaque transfection. Vingt- quatre heures après la transfection, le milieu de culture a été changé. Quarante-huit heures après la transfection, les surnageants viraux ont été récoltés et congelés à -80 °C.
1.5 Production de virus par transfection stable
Dix-neuf µg de plasmides rétroviraux pSIN.CMV-GFP, pSIN.CMV-GFP-WPRE, pSIN.CMV- GFP-WPRE.SV40 et pSIN.CMV-GFP-WPRE.SV40-BGH ont été cotransfectés avec 1 µg de pMD2.Hygro (produit par KG), codant pour le gène de résistance à l’hygromycine, par transfection au
phosphate de calcium dans les 293Vec-RD114. Les cellules transfectées ont été sélectionnées avec 200 µg/mL d’hygromycine et la sélection a été maintenue en tout temps. Quinze jours après la transfection, les cellules positives pour GFP (acronyme de la terminologie anglaise pour Green
Fluorescent Protein; protéine fluorescente verte) ont été triées au COULTER EPICS Elite ESP
(Beckman Coulter). Lorsque la confluence des cellules était autour de 90 %, le milieu de culture a été changé. Le milieu de culture a été récolté lorsque les cellules étaient à confluence.
Le plasmide pSIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH.TK-BSD a été transfecté de façon stable dans les 293Vec-Ampho au phosphaste de calcium (257). Les cellules transfectées ont été sélectionnées avec 10 µg/mL de blasticidine sur une période de 10 jours. Les cellules ont été clonées par dilution limite dans des plaques 96 puits et 132 clones ont été analysés en plaques 12 puits. Le meilleur clone a été sous-cloné et 37 sous-clones ont été isolés de façon similaire. La sélection à la blasticidine a été maintenue en tout temps. Lorsque la confluence des cellules était autour de 90 %, le milieu de culture a été changé. Le milieu de culture a été récolté 24h plus tard puis changé et récolté de façon journalière.
1.6 Transductions
Les cellules MNNG/HOS, 143B, MCF7, TE671, HeLa, MG-63 et HT-1080 ont été ensemencées à raison de 105 cellules par puits dans des plaques 24 puits (SARSTEDT). Vingt-
quatre heures plus tard, les cellules HT-1080 d'un puits ont été comptées avec un hématimètre pour déterminer les titres viraux, le milieu de culture des autres puits a été retiré, puis les cellules ont été transduites avec des dilutions successives de virus en présence de 8 µg/ml de polybrène (PB). L’efficacité de transduction a été analysée par cytométrie en flux 72 heures après la transduction. Les titres viraux ont été déterminés en mesurant le nombre de cellules GFP positives et ont été calculés comme suit : Titre = ! × !"#$
! × 𝐷, où F est le pourcentage de cellules positives déterminé par cytométrie en flux; Cinf est le nombre total de cellules au moment de l’infection; V est le volume de surnageant viral ajouté; D est le facteur de dilution du virus. Seuls les pourcentages de transduction compris entre 2-20 % ont été considérés pour le calcul des titres viraux.
ensemencées par puits dans des plaques 12 puits (Corning) contenant une CNH et les cellules ont été laissées adhérer pendant 4 heures avant d’être transduites. Les kératinocytes et fibroblastes ont été transduits avec SIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH et MFG-HYGRO.IRES-GFP produits du façon stable en remplaçant le milieu de culture par des dilutions de surnageant viral dans un volume final de 500 µL en présence de 8 µg/mL de polybrène ou de 10 µg/mL de peptide EF-C (peptide polycationique). Six heures plus tard, le milieu de culture des fibroblastes et kératinocytes a été changé. Soixante-douze heures après la transduction, l’expression de GFP a été observée par microscopie à fluorescence et l’efficacité de transduction des vecteurs a été analysée par cytométrie en flux.
1.7 Microscopie à fluorescence
Les kératinocytes et fibroblastes transduits par MFG-HYGRO.IRES-GFP ont été analysés par microscopie à statif inversé Zeiss Axio Observer.A1 (ZEISS) pour la détection de GFP 72 et 48 heures après la transduction respectivement.
1.8 Immunofluorescence et cytométrie en flux
Les cellules transduites avec les rétrovirus GFP ont été analysées par cytométrie en flux. Les cellules MNNG/HOS, 143B, MCF7, TE671, HeLa, MG-63, HT-1080 et les kératinocytes ont été trypsinées 72 heures après la transduction et 48 heures dans le cas des fibroblastes, puis analysés pour l’expression de la GFP. La fluorescence a été mesurée avec un analyseur de cellules BD LSRFortessa (BD Biosciences) et le programme BD FACSDiva Software v6.2 (BD Biosciences).
L’expression de COLVII dans les cellules transduites par les rétrovirus COL7A1 et les lignées d’encapsidations a été analysée par immunofluorescence. Les cellules HT-1080 et les kératinocytes ont été trypsinés 72 heures après la transduction et 48 heures dans le cas des fibroblastes. Les cellules ont été fixées avec 250 µL de BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) suivi de 250 µL de BD Perm/Wash (BD Biosciences). Les cellules ont été incubées 30 minutes sur glace avec une solution de 100 µL d’anticorps primaire monoclonal de souris ciblant la partie NC1 du COLVII (Clone LH7.2) et de BD perm/wash (1:1000) (Sigma-Aldrich). Les cellules ont été lavées
deux fois avec 250 µL de BD Perm/Wash puis incubées 30 minutes sur glace en présence de 100 µL d’anticorps secondaire de chèvre anti-souris conjugué à Alexa488 (Life Technologies, A-11029) dilué (1:1000) dans du BD Perm/Wash. Les cellules ont été lavées 2 fois avec 250 µL d’une solution de tampon phosphate salin contenant 1 % d'albumine de sérum bovin (Invitrogen) puis analysées par cytométrie en flux.
1.9 Analyses statistiques
Le test de Tukey a été réalisé pour la comparaison des groupes dans les analyses des titres viraux des productions transitoires et stables. Le test de Student a été réalisé pour la comparaison des groupes de SIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH et SIN.CMV-COL7A1-WPRE.SV40-BGH produits par le système d'expression stable. Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives à partir de P < 0,05. Toutes les données analysées sont exprimées comme la moyenne ± écart type.