Chapitre 2. Résultats
2.2 Génération d'un clone producteur de virus COL7A1 à titre élevé
2.2.1 Génération des cellules productrices de virus
Puisque les vecteurs SIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH et SIN.CMV-COL7A1-WPRE.SV40- BGH ont généré des titres viraux similaires en production transitoire (Figure 11) et que la séquence WPRE n'améliore pas significativement l'intensité de fluorescence moyenne de SIN.CMV-COL7A1-
WPRE.SV40-BGH (données non présentées), le vecteur sans la séquence WPRE, SIN.CMV- COL7A1.SV40-BGH, a été choisi pour générer un clone stable (276).
La cassette de sélection à la blasticidine TK-BSD-SV40 a été incorporée dans pSIN.CMV- COL7A1.SV40-BGH, ce qui a généré pSIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH.TK-BSD, afin de sélectionner les cellules d'encapsidation ayant acquis ce plasmide (KG) (289). Cette cassette contient un promoteur faible, celui de la TK (290, 291). Il permet d’exprimer la BSD qui n’est normalement pas présente dans les cellules eucaryotes et confère une résistance à la blasticidine S (292). Un promoteur faible a été choisi, car il devrait permettre de sélectionner les cellules qui ont intégré plusieurs copies de ce plasmide. Obtenir un nombre élevé de vecteurs viraux intégrés dans le génome des cellules d'encapsidation est crucial, car cela permet une plus grande expression de l'ARNg du vecteur, qui peut être un facteur limitant pour la productivité virale, ce qui est un atout important pour les cellules 293Vec qui produisent des titres viraux élevés (249, 266, 293). Comme la cassette de sélection TK-BSD-SV40 n'est pas présente dans l'ARNg de SIN.CMV-COL7A1.SV40- BGH (Figure 8), le rétrovirus issu de pSIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH.TK-BSD est nommé SIN.CMV- COL7A1.SV40-BGH pour la suite.
Les enveloppes fréquemment utilisées pour pseudotyper les γ-rétrovirus sont : Amphotropique 4070A, GaLV et RD114 (249, 253). L’enveloppe ampho 4070A, désignée "enveloppe ampho" pour la suite, a été choisie pour pseudotyper le vecteur SIN, car son récepteur d’entrée cellulaire Pit2 (Sodium-dependent phosphate transporter 2) est exprimé abondamment sur les cellules à transduire (fibroblastes et kératinocytes) (58, 294). De plus, l'enveloppe ampho transduit légèrement mieux les fibroblastes humains que les enveloppes GALV et RD114 et transduit les kératinocytes à un niveau similaire à ces deux enveloppes (295). Ainsi, pSIN.CMV-COL7A1.SV40- BGH.TK-BSD a été transfecté de manière stable dans les cellules 293Vec-Ampho (KG).
2.2.2 Sélection de la lignée de titration
Différentes lignées cellulaires ont été testées pour identifier celle exprimant le plus fortement le transgène du vecteur SIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH, COL7A1-opt., afin d'augmenter la précision lors des titrations subséquentes des clones producteurs de virus. Le vecteur SIN.CMV- COL7A1.SV40-BGH produit par transfection stable par une population de cellules d'encapsidation
293Vec-Ampho a été utilisé pour transduire les lignées MNNG/HOS, 143B, MCF7, TE671, HeLa, MG-63 et HT-1080 (Figure 12). L'IFM (intensité de fluorescence moyenne) la plus élevée, soit 1803, a été obtenue avec les cellules HT-1080, suivi d'une IFM de 1470 avec les cellules MG-63. Les cellules MNNG/HOS, 143B, MCF7, TE671, HeLa ont exprimé le vecteur avec une IFM comprise entre 619 et 898. Les cellules HT-1080 ont été choisies pour les expériences de titration de SIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH puisqu’elles expriment le plus fortement le transgène de ce vecteur et permettront conséquemment de distinguer avec une meilleure précision les cellules transduites qui expriment faiblement le vecteur des cellules non-transduites.
Figure 12. Analyse de la fluorescence de COLVII dans différentes lignées cellulaires par cytométrie en flux. Transduction de cellules MNNG/HOS, 143B, MCF7, TE671, HeLa, MG-63 et HT-1080 avec SIN.CMV-
COL7A1.SV40-BGH pseudotypé avec l'enveloppe ampho produit par production stable par une population de cellules d'encapsidation. Les cellules transduites ont été marquées par immunofluorescence contre le COLVII et analysées par cytométrie en flux. Les valeurs présentées sont représentatives d'un réplicat biologique.
2.2.3 Isolement du meilleur clone
132 clones produisant le vecteur SIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH pseudotypé de l’enveloppe ampho ont été isolés (KG) et titrés afin d’identifier celui ayant intégré le plus de copies fonctionnelles de pSIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH et qui produit le titre viral le plus élevé. Les clones 38, 58, 43 et 29 ont généré les titres les plus élevés soit 4,0 x 105, 5,2 x 105, 8,4 x 105 et 9,6 x 105 UI/mL
respectivement (Figure 13A). Un total de 25,1 %, 47,5 %, 48,4 % et 54,4 % de cellules positives pour COLVII a été identifié pour les clones 38, 58, 43 et 29 respectivement (Figure 13B). Le clone 29 a généré le titre viral le plus élevé et avait le plus de cellules positives pour COLVII. Ce clone a été sélectionné pour la suite des expériences.
A) B)
Figure 13. Criblage des clones 293Vec-Ampho exprimant SIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH par cytométrie en flux et analyse de la fluorescence de COLVII de ces clones. A) Titres viraux des quatre meilleurs clones
producteurs de virus SIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH par transduction sur des cellules HT-1080 et B) pourcentage des cellules d'encapsidation positives pour COLVII. Les cellules transduites et les cellules d'encapsidation ont été marquées par immunofluorescence contre le COLVII et analysées par cytométrie en flux. Les valeurs présentées sont chacune représentatives d'un réplicat biologique. UI, unités infectieuses.
2.2.4 Sous-clonage et identification du moment optimal de récolte des surnageants viraux
En vue d'obtenir un clone avec 100 % de cellules positives pour COLVII, le clone 29 a été sous-cloné et 37 sous-clones ont été isolés (KG) et titrés et leur pourcentage de cellules positives pour COLVII a été analysé. Les sous-clones 9 et 24 ont généré les titres viraux les plus élevés (données non-présentées). Or, les titres viraux du système d’expression stable sont limités par la croissance des cellules et augmentent au cours de la phase exponentielle de culture cellulaire (249, 296, 297). De plus, lors de la phase de plateau de croissance cellulaire, les titres viraux diminuent dus à la mortalité cellulaire, une baisse des nutriments disponibles et à l’inactivation des particules virales en solution qui est alors plus élevée que leur vitesse de production (297, 298). Ainsi, afin d'identifier titres viraux maximums des sous-clones 9 et 24, le surnageant viral a été récolté à différents moments et une cinétique de productivité virale a été produite sur trois jours (Figure 14A). La récolte du surnageant du sous-clone 9 aux jours 1, 2 et 3 a été utilisé pour transduire des cellules HT-1080 et des titres viraux de 4,4 x 105, 9,8 x 105 et 6,9 x 105 UI/mL ont été obtenus respectivement
respectivement (Figure 14A). Le sous-clonage a donc permis d’isoler le sous-clone 9 qui a produit un titre viral légèrement supérieur (Figure 14A) au clone parental (#29) (Figure 13A).
A) B)
Figure 14. Cinétique de la production virale et analyse de la fluorescence de COLVII des clones 293Vec-Ampho exprimant SIN.CMV-COL7A1.SV40-BGH par cytométrie en flux. A) Titres viraux des sous-
clones 9 et 24 par transduction sur des cellules HT-1080 avec des surnageants viraux récoltés aux jours 1, 2 ou 3 après confluence et B) leur pourcentage de cellules positives pour COLVII ainsi que pour le clone parental 29. Les cellules transduites et les cellules d'encapsidation ont été marquées par immunofluorescence contre le COLVII et analysées par cytométrie en flux. Les valeurs présentées sont chacune représentatives d'un réplicat biologique. UI, unités infectieuses; C., clone; S.-C., sous-clone.
Lorsque les surnageants viraux ont été récoltés pour établir la cinétique de production virale, le pourcentage de cellules positives pour COLVII des sous-clones 9 et 24 a aussi été analysé (Figure 14B) ainsi que pour le clone 29 comme contrôle. Les sous-clone 9 et 24 avaient 83,2 % et 71.9 % de cellules positives pour COLVII respectivement tandis que le clone 29 en avait 33,6 % (Figure 14B). Le sous-clonage a donc également permis d'isoler un sous-clone (#9) contenant davantage de cellules positives pour COLVII que le clone parental (#29).