TIAR régule la synthèse de TNF-a

a) L’ARNm du TNF-a est un ligand de la protéine TIAR dans des cellules RAW 264.7 stimulées au LPS

Les analyses par biopuces des ARNm immunoprécipités avec TIAR-Flag révèlent que l’ARNm du TNF-a serait un ligand important de la protéine TIAR dans les cellules stimulées au LPS. En effet, ce transcrit est enrichi d’un facteur 10 dans l’IP par rapport au transcriptome total des mêmes cellules en condition de stimulation par le LPS. Nous avons tout d’abord confirmé la liaison de TIAR à l’ARNm du TNF-a par la méthode RIP à partir de cellules RAW 264.7 surexprimant la protéine TIAR-Flag en condition de stimulation par le LPS. Les ARNm ainsi immunoprécipités ont été rétro-transcrits avec une amorce oligo-dT. Enfin, des amorces spécifiques à la séquence codant pour le TNF-a ont été utilisés en PCR quantitative (qPCR) afin de détecter son enrichissement dans le culot de l’IP de la protéine TIAR-Flag. L’enrichissement obtenu par qPCR est relatif à la quantité d’ARNm du TNF-a obtenu en procédant à la même IP sur des cellules RAW 264.7 sauvages n’exprimant pas TIAR-Flag et dont le nombre a été arbitrairement fixé à un. Nous avons utilisé des amorces s’hybridant à la séquence codant pour la GAPDH pour normaliser nos résultats afin d’éliminer les effets de fluctuation des quantités d’ARNm engagées dans l’expérience. Comme on peut le voir, l’ARNm du TNF-a est enrichi d’un facteur 10 dans le culot de l’IP TIAR-Flag par rapport au contrôle négatif, confirmant ainsi les résultats obtenus lors des analyses par biopuce (Figure 9). Afin de déterminer le ou les domaines de liaison de la protéine TIAR à l’ARNm du TNF-a, nous avons répété l’expérience en immunoprécipitant les mutants TIARARRM2, TIARARRM3 et TIARA50. Si les mutants tronqués au niveau des domaines RRM ne fixent plus du tout l’ARNm du TNF-a, le mutant A50 tronqué dans la première partie de son extrémité carboxy-terminale ne semble pas perdre toute affinité pour le transcrit, même si celle-ci est fortement diminuée. On peut en conclure que les domaines RRM2 et RRM3 sont nécessaires à la liaison de TIAR à l’ARNm du TNF-a.

Contrôle- TIAR-Flag TIARARRM2 TIARA50 TIARARRM3

Figure 11 : Affinité de la protéine TIAR-Flag et des mutants de TIAR (mêmes clones que pour fig. 10) pour T ARNm de MKP-1 en réponse au LPS (lOOng/ml, 2h). Les extraits protéiques sont réalisés selon la méthode RIP à partir des différentes lignées monoclonales de cellules RAW 264.7 exprimant TIARflag et ses différents mutants ou de cellules RAW 264.7 sauvages comme contrôle négatif 750 pg d’extraits protéiques par échantillon sont immunoprécipités par des billes anti-Flag. Les ARNm sont rétro-transcrits à l’aide d’oligo-dT. Des oligonucléotides spécifiques de la séquence codant pour MKP-1 sont utilisés pour réaliser la qPCR. Les résultats représentent l’enrichissement relatif en ARNm de MKP-1 détecté par qPCR dans chaque échantillon par rapport au contrôle négatif dont la valeur est arbitrairement fixée à 1. Nous avons utilisé des oligonucléotides spécifiques de la séquence codant pour la GAPDH afin de normaliser nos résultats. La moyenne des résultats de trois expériences indépendantes est présentée (p- value<0,05). Temps (mn) WT O 20 40 60 120 180 ____________ TIAR-Flag__________ 0 20 40 60 120 180 MKP-1 ■ -MKP-1 Actine A TCfTlpS ÿm) WT TIAR-4=lag O 20 40 80 120 ISO O 20 40 60 120 180 MKP-1 Gflpitl MKP-1/QaiKli; 02 0.7 12 1.7 1.8 1.8 0.3 0.4 0.7 I 1.1 1 B

Figure 12 ; Effet de la surexpression de la protéine TIAR-Flag sur l’expression du gène MKP-1 dans des cellules RAW 264.7 stimulées au LPS. A) Détection de la protéine MKP-1 par western blot à l’aide d’un anticorps anti- MKP-1 sur des extraits protéiques de RAW 264.7 sauvages (WT) ou surexprimant TIARflag (clone 1, voir fig. 2A) stimulées par lOOng/ml de LPS pendant 0, 20, 40, 60, 120 ou ISOmn. 20pg d’extraits sont chargés par piste. Nous avons utilisé un anticorps anti-actine afin de normaliser nos résultats. La détection du signal émis est réalisée par une caméra CCD. Le western blot est représentatif de trois expériences.*Bande aspécifique détectée par l’anticorps MKP-1. B) Mesure par northem blot de l’accumulation de l’ARNm de MKP-ldans des cellules RAW 264.7 sauvages ou surexprimant TIARflag (clone 1) stimulées par lOOng/ml de LPS pendant 0, 20, 40, 60, 120 ou 180mn. 8 pg d’ARN sont chargés par piste. Une sonde radioactive complémentaire à toute la séquence codant pour MKP-1 est utilisée pour détecter l’ARNm. Nous avons utilisé le gène de la GAPDH pour normaliser les résultats. Les signaux radioactifs sont révélés par phosphoimager™ et le signal émis par les sondes est quantifié par le programme imagequant©. Le rapport des signaux correspondant aux ARNm MKP-1 et GAPDH est indiqué en dessous de chaque piste. Cette expérience est représentative de trois expériences indépendantes.

a) Les cellules RAW 264.7 surexprimant la protéine TIAR produisent moins de TNF-g en réponse au LPS

Ayant confirmé la liaison de la protéine TIAR à TARNm du TNF-a, nous avons examiné l’effet d’une surexpression de TIAR-Flag sur la production de la protéine TNF-a par des macrophages stimulés au LPS. L’expérience a été réalisée sur trois clones indépendants. Nous avons ainsi constaté une production de TNF-a moins élevée dans les RAW 264.7 surexprimant TIAR-Flag que dans les RAW 264.7 sauvages (Figure lOA). En outre, cet effet semble corrélé avec le taux d’expression de la protéine TIAR-Flag (Figure 1 A). Afin de déterminer si l’effet répresseur de la protéine TIAR sur la synthèse de TNF-a est traductionnel ou affecte la stabilité de l’ARNm ou la transcription du gène codant pour le TNF-a, nous avons examiné l’accumulation de l’ARNm en réponse au LPS dans les différents clones de RAW 264.7 exprimant la protéine TIAR-Flag (Figure lOB). On observe que l’accumulation de l’ARNm du TNF-a en réponse au LPS ne diminue pas significativement dans les clones 2 et 3. Ces résultats suggèrent que l’essentiel de l’effet répresseur de la protéine TIAR sur la synthèse de TNF-a est d’origine traductionnel le. Le clone 1, dans lequel la surexpression de la protéine TIAR-Flag est plus importante, présente une accumulation de l’ARNm du TNF-a nettement moindre que dans les cellules RAW 264.7 sauvages ou les clones 2 et 3. Ce résultat confirme l’effet observé sur l’expression du TNF-a suite à une surexpression de la protéine TIAR-Flag lors de l’analyse par biopuce. Néanmoins, il n’explique pas complètement la répression de la synthèse de TNF-a en réponse au LPS. En effet, l’effet inhibiteur observé sur la protéine reste plus important que celui observé sur l’ARNm. On peut en conclure que lorsque TIAR-Flag est modérément surexprimée, l’effet inhibiteur de la protéine sur la production de TNF-a est essentiellement d’ordre traductionnel. Lorsque la protéine TIAR-Flag est plus fortement surexprimée, un effet transcriptionnel ou déstabilisateur de TARNm se manifeste.

WT Temps (mn) 0 ₂₀ 40 60 120 p-p38 Actine -► p38 total -► Tiar entier 0 20 40 60 120 B Temps -WT -Tiar entier

Figure 13: EfTet de la surexpression de la protéine TIAR-Flag sur la phosphorylation de la MAP kinase p38 dans des cellules RAW 264.7 stimulées au LPS A) Détection de la kinase p38 phosphorylée par western blot sur des extraits protéiques de cellules RAW 264.7 sauvages (WT) ou surexprimant TIAR-Flag (clone 1, voir figure 2A) stimulées par lOOng/ml de LPS pendant 0, 20, 40, 60 ou 120mn. 20pg d’extraits sont chargés par piste. Nous avons utilisé un anticorps reconnaissant spécifiquement la forme phosphoiylée de p38 (p-p38) ainsi qu’un anticorps reconnaissant les formes phosphorylées et non phosphorylées de p38 (p38 total). Nous avons utilisé un anticorps anti-actine afin de normaliser nos résultats. La détection du signal émis est réalisée par caméra CCD. Le western blot est représentatif de trois expériences indépendantes B) Graphique représentant le taux de phosphorylation de p38 au cours du temps après stimulation des cellules par le LPS. Le graphe représente l’intensité relative du signal émis par le p-p38 des cellules sauvages et surexprimant TIAR-Flag stimulées au LPS par rapport à l’intensité du signal émis par le p-p38 des cellules RAW 264.7 sauvages (WT) non stimulées au LPS (temps=0) et dont la valeur est arbitrairement fixée à 1. Toutes les mesures de signal sont réalisées par caméra CCD. Le graphe réprésente la moyenne des résultats obtenus sur trois expériences indépendantes (p-value< 0,05).