Etude de la fonction de la protéine TIAR au cours du développement embryonnaire

3.1) Développement embryonnaire anormal chez les individus issus du croisement de

souris transgéniques GFP-TIAR avec des souris transgéniques Pgk-Cre

Nos premières expériences visant à étudier l’effet de la surexpression de la protéine TIAR in vivo

par transgenèse par addition de la construction pBap-TIARJlag 3 ’ suggèrent que celle-ci induit

une mortalité embryonnaire importante (Figure 15). Nous avons donc utilisé les souris

transgéniques portant la construction pBap-GFPlox-TLARflag 3’ pour caractériser l’effet de la

surexpression de TIAR au cours du développement embryonnaire. Cette partie du travail a été réalisée dans le laboratoire de Biologie du Développement de Dominique Morello à Toulouse.

Nous avons donc croisé les mâles <jFP-T1AR des lignées a et p (plus de 100 copies du transgène)

avec des femelles transgéniques contenant le transgènepgk-cre. Grâce à l’accumulation de la Cre

dans l’oocyte, la recombinaison du transgène devrait avoir lieu dès que le génome mâle est accessible à la recombinase, c'est-à-dire probablement dès l’étape de fusion des pronuclei (Lallemand et al., 1998). De manière surprenante, le génotypage de la descendance révèle qu’à peine 27,6% des descendants portent le transgène, un pourcentage significativement inférieur aux 50% observés pour 1a transmission d’un transgène hétérozygote. Cette diminution de la transmission du transgène a été observée peu importe la lignée transgénique utilisée mais pas dans le cas des croisements entre la lignée GFP-TIAR et la lignée sauvage ou lors de croisements entre la lignée GFP-TIAR et la lignée Scy-Cre qui n’exprime pas la recombinase Cre durant l’oogenèse (Figure 20A). Ces résultats suggèrent que cette transmission réduite n’est pas due à une toxicité du transgène lui-même mais probablement à l’activation de l’expression de TIAR par

excision de la cassette GFP par la recombinase Cre exprimée par le gène Pgk-Cre. Pour tester

cette hypothèse, nous avons comparé le développement d’embryons issus de croisements entre

des mâles GFP-TIAR et des femelles de la lignée Pgk-Cre ou des femelles sauvages. Nous avons

collecté les embryons entre le 9® et le 17® jour de gestation et comptabilisé le nombre d’embryons normaux et dégénérés qui présentent des déciduas vides. Comme on peut le voir dans la figure 20B, la létalité embryonnaire est significativement plus élevée quand les mâles GFP-TIAR sont

Figure 21: Recombinaison de la collection de transgènes par la recombinase Cre et expression subséquente de la protéine TIAR. A) Représentation schématique des possibilités de recombinaison de la collection de transgènes par la recombinase Cre. B) PCR réalisée à l’aide d’oligonucléotides spécifique de la GFP (panneau du haut) ou de TIAR (panneau du bas) à partir d’ADN génomique extrait des queues d’individus GFP-TIAR (collection de transgènes non recombinée), GFP-TIAR^ (collection de transgènes partiellement recombinée) et TIAR-GFP^' (collection de transgènes totalement recombinée). C) RT-PCR semi-quantitative réalisées à partir des ARN extraits des testicules d’individus sauvages (WT), GFP-TIAR^ et GFP-TIAR'^. Trois couples d’amorces sont utilisés: le premier amplifie la partie codante des protéines TIAR transgéniques et endogènes (panneaux du haut), le second amplifie la partie 3’ non traduite du transgène (panneaux centraux) et le dernier amplifie la séquence codant pour la protéine ribosomique S16 (panneaux du bas). Le nombre de cycles utilisé pour générer les fragments PCR présents sur le gel est indiqué (23, 26 et 29). D) Western blot anti-TIAR (panneau en haut à gauche), anti-Flag (panneau en haut à droite) et anti­ tubuline (panneau du bas) réalisés à partir d’extraits protéiques de testicules d’individus WT, GFP-TIAR*’’ et GFP- TIAR**. *Bande aspécifique reconnue par l’anticorps anti-Flag. La tête de flèche indique le signal correspondant à la protéine TIAR-Flag.

sauvages (8,2%). Ces résultats a posteriori expliquent pourquoi nous obtenons une aussi faible proportion d’individus transgéniques au sein des portées issues de ce croisement et suggèrent fortement qu’une surexpression de la protéine TIAR est incompatible avec un développement embryonnaire normal.

Les souris transgéniques viables que nous obtenons pourraient être des individus présentant un nombre peu élevé de copies du transgène impliquant une faible expression de celui-ci, de sorte que leur développement embryonnaire se déroule normalement. Cette hypothèse suggère que la recombinase Cre n’excise pas la cassette GFP avec la même efficacité chez tous les individus et génère par conséquent une collection hétérogène d’embryons possédant un nombre de copies du transgène différent et exprimant TIAR à des degrés variables. Afin d’évaluer cette hétérogénéité, nous avons mesuré le taux de recombinaison du transgène chez les individus transgéniques viables en analysant la présence de la cassette GFP par PCR sur de l’ADN de queues à l’aide d’amorces spécifiques de la GFP. Nous avons ainsi constaté que la recombinase Cre élimine complètement la cassette chez certains descendants (GFP-TIAR^‘) tandis qu’elle ne l’élimine que partiellement chez d’autres (GFP-TIAR^'’) (Figure 21A et 21 B).Cette analyse confirme donc bien la variabilité de l’activité de la recombinase Cre. D’autre part, l’amplification du transgène abroge complètement l’amplification du gène endogène par compétition dans la souche parentale GFP-TIAR où le nombre de copies du transgène est très élevé. Cette compétition est clairement atténuée pour les échantillons d’ADN issus des descendants viables GFP-T1AR^‘ ou GFP- TIAR^’’, et ceci en parfaite corrélation avec une réduction du nombre de copies du transgène TIAR après recombinaison par la recombinase Cre.

Comme il était difficile de corréler le nombre de copies du transgène avec son expression dans les embryons dégénérés, nous avons décidé de tester cette hypothèse à travers l’analyse de l’expression de TIAR tant du point de vue de l’ARNm que de la protéine dans les testicules, le seul tissu exprimant le transgène chez les individus transgéniques viables. De manière intéressante, les tests par RT-PCR semi-quantitative révèlent que l’expression du transgène TIAR est significativement plus élevée dans les testicules de souris où le transgène est partiellement recombiné (GFP-TIAR'^'’) que dans les testicules de souris où le transgène est complètement recombiné (GFP-TIAR^*) (Figure 21C). Nous obtenons des résultats concordant avec

Stade observé: E65

B

Développement embryonnaire post-implantatoire

100% 80% 60% 40% 20% 0% ■ Dédduavkit: ■ Rebadc/anurmal ■ Normal C5.5(n-15) C6.5 (n-6) C7^(n=20) xTO

Figure 22: Développement embryonnaire post-implantatoire des embryons transgéniques GFP-TIAR x Pgk Cre. A) Des embryons ont été collectés entre les stades E5.5 et E7.5 sur des femelles Pgk-Cre précédemment accouplées avec des mâles hétérozygotes GFP-TIAR. Leur stade de développement a été déterminé selon des critères morphologiques. Les images présentées sont représentatives des embryons analysés entre les stades E6.5 et E7.5 et correspondent à des embryons au développement normal ou retardé. B) Des embryons ont été collectés entre les stades E5.5 et E7.5 sur des femelles Pgk-Cre précédemment accouplées avec des mâles homozygotes GFP-TIAR. Leur stade de développement a été déterminé selon des critères morphologiques. L’histogramme représente les proportions en pourcentage d’embryons normaux, retardés/anormaux ou dont les déciduas sont vides pour chaque stade de développement, n est le nombre d’embryons observés. Des photos représentatives d’embryons à chaque stade de développement sont présentées sous le graphe. Elles montrent, qu’excepté pour le stade E5.5, la plupart des embryons sont retardés dans leur développement.

l’expression de la protéine (Figure 21D). Ces données indiquent qu’une excision partielle des cassettes GFP pourrait induire une expression plus élevée de la protéine transgénique TIAR

qu’une excision totale produisant un transgène fi-Actine-loxP-TlARJlag 3’ en une seule copie

(voir figure 21 A). Transposé au développement embryonnaire, ce raisonnement implique qu’une excisiorr partielle des cassettes GFP conduirait à un taux d’expression plus élevé qu’une recombinaison totale, induisant ou non une létalité embryonnaire selon le nombre et/ou la localisation des cassettes GFP excisées dans la collection de transgènes.

3.2) Dégénérescence post-implantatoire des embryons issus du croisement entre la lignée

Pgk-Cre et la lignée GFP-TIAR

Nous avons ensuite tenté de déterminer le stade du développement embryonnaire auquel les

embryons commencent à dégénérer in utero. Dans ce but, nous avons examiné le développement

d’embryons issus du croisement entre des mâles hétérozygotes GFP-TIAR des lignées a et P et

des femelles Pgk-Cre au cours des stades E5.5, E6.5 et E7.5. Théoriquement, tous les oocytes de

ces femelles (qu’elles soient hétérozygotes ou homozygotes) expriment la recombinase Cre qui est capable de recombiner l’allèle paternel du transgène transmis une fois sur deux. Nous pouvons donc comparer au sein de la même portée des embryons sauvages aux embryons transgéniques surexprimant TIAR. Nous avons classé les embryons en trois catégories: développement normal, développement tardif/anormal et embryons complètement dégénérés ou dont les déciduas sont vides. Les résultats indiquent que la plupart des embryons de la même portée ont un développement normal au stade E5.5 mais qu’il y a un nombre croissant d’embryons au développement tardif ou anormal qui apparaissent au cours du temps (Figure 22A). Afin de déterminer si les embryons dégénérés et au développement tardif sont transgéniques, nous avons soit cultivé le cône ectoplacental (ECC) d’embryons au stade E5.5-6.5, soit directement extrait l’ADN des sacs vitellins d’embryons au stade E7.5 afin de procéder à des analyses par PCR semi-quantitatives à l’aide d’oligonucléotides spécifiques de TIAR. Nous avons ainsi pu observer que les sacs vitellins ou les ECC d’embryons en apparence normaux ne contenaient pas ou très peu de copies du transgène tandis que ceux extraits d’embryons dégénérés ou au développement tardif produisaient un signal PCR bien plus important correspondant à un

B

Croissance «n ufero jusqu'au stade Uastocyste(X)

loq 80 60' 40 20 0+ ■ I TIARxWT TMRxI^-Oe ln=S5) |n=37) C

Croissance in vitro (M16) jusqu'au stade blastocyste(%)

wrxwr TIARxWT T1ARxP){k-Cre

(n=22) (n=67) (n=114)

E

G2 WT TIAR

Figure 23 : Sensibilité des embryons transgéniques aux conditions de culture in vitro. A) Des embryons sont prélevés

à différents stades pré-implantatoires sur des femelles sauvages précédemment accouplées avec des mâles GFP- TIAR homozygotes afin d’observer l’expression de la GFP. L’expression de la GFP commence au stade morula. B) Les embryons de femelles sauvages (WT) ou Pgk-Cre accouplées avec des mâles GFP-TIAR (TIAR) homozygotes sont prélevés à E3.5 et examinés pour déterminer la proportion d’entre eux parvenus au stade blastocyste. L’histogramme représente le pourcentage de blastocystes normaux, n est le nombre d’embryons prélevés C) Les embryons de femelles WT ou Pgk-Cre accouplées avec des mâles WT ou GFP-TIAR (TIAR) homozygotes sont prélevés entre les stades 1-cellule et 8-cellules et mis en culture dans le milieu M16. Le nombre d’embryons parvenus au stade blastocyste est exprimé dans l’histogramme en termes de pourcentage du nombre d’embryons prélevés, n est le nombre d’embryons prélevés. D) Comparaison au stade blastocyste d’embryons prélevés entre le stade une-cellule et le stade morula sur des femelles WT accouplées avec des mâles WT (WT)ou sur des femelles Pgk-Cre accouplées avec des mâles GFP-TIAR (TIAR) et mis en culture dans le milieu Ml6. E) Comparaison au stade blastocyste d’embryons prélevés entre le stade une-cellule et le stade morula sur des femelles WT croisées avec des mâles WT (WT) ou sur des femelles Pgk-Cre croisées avec des mâles GFP-TIAR (TIAR) et mis en culture dans le milieu G2.

nombre de copies significativement plus élevé (données non présentées). Dans le but d’obtenir des données plus aisément quantifiables, nous avons répété l’expérience avec cette fois des mâles homozygotes GFP-TIAR issus des lignées a et p. On peut voir dans la figure 22B que le pourcentage d’embryons dégénérés ou présentant un développement tardif augmente de manière considérable au cours du temps, le nombre d’embryons apparemment normaux passant de 80% au stade E5.5 à 23% au stade E7.5 (Figure 22B). L’ensemble de ces résultats indique que les embryons issus du croisement GFP-TIAR x PGK-Cre deviennent rapidement non viables après implantation.

3.3) Sensibilité importante des blastocvstes PGK-Cre x GFP-TIAR aux conditions de

culture in vitro

L’observation d’une létalité embryonnaire précoce ainsi que la capacité de la recombinase Cre à exciser les cassettes GFP dès le stade une-cellule nous a conduits à poser l’hypothèse que TIAR pourrait être accumulé durant les stades préimplantatoires du développement. Pour déterminer à partir de quel stade embryonnaire pourrait commencer l’accumulation de la protéine TIAR-Flag, nous avons examiné l’expression de la GFP dans des embryons aux stades préimplantatoires issus du croisement WT x GFP-TIAR afin de visualiser l’expression du transgène à partir du stade morula (Figure 23A). Les résultats révèlent que le promoteur de la P-actine n’est pas pleinement efficace avant le stade morula. Par conséquent, la protéine TIAR-Flag ne peut être exprimée avant ce stade, même après recombinaison du transgène par la recombinase Cre. Pour tester les conséquences de l’expression potentielle de la protéine TIAR-Flag avant implantation,

nous avons prélevé in utero les blastocystes de femelles WT ou Pgk-Cre croisées avec des mâles

GFP-TIAR homozygotes. Nous avons observé une proportion semblable d’embryons normaux pour ces différents croisements (Figure 23B). Ensuite, les embryons issus de croisements entre des mâles GFP-TIAR homozygotes des lignées a et P avec des femelles sauvages ou PGK-Cre

ont été isolés entre le stade une-cellule et le stade morula et cultivés in vitro dans le milieu Ml6.

Tandis que la plupart des morulas provenant de femelles sauvages atteignent le stade blastocyste, les embryons des femelles PGK-Cre dégénèrent rapidement et aucun d’entre eux n’atteint ce stade (Figure 23C et D). De manière surprenante, la plupart des embryons, qu’ils proviennent de

■ . . • > ■ • J- '

femelles sauvages ou de femelles PGK-Cre, se développent normalement lorsqu’on les cultive dans du milieu G2 (Figure 23E). Ces résultats indiquent que les morulas surexprimant la protéine TIAR sont beaucoup plus sensibles aux conditions de culture que les morulas sauvages et que leur développement préimplantatoire dépend de conditions favorables (milieu G2 ou

développement in utero) ou de conditions de stress (Milieu Ml6). Ces données suggèrent que

l’accumulation de TIAR n’interfere probablement pas avec le développement préimplantatoire des embryons.

1) Etude de la fonction de la protéine TIAR au cours de la réponse immune innée dans la lignée cellulaire RAW 264,7

Cela fait maintenant quelques années que l’on sait que la MARK p38 est impliquée dans le métabolisme des cytokines en réponse au LPS (Han et al., 1994 ; Lee et al., 1994). Le lien entre l’activation de cette kinase et la stabilisation de l’ARNm du TNF-a a notamment été mis en évidence par les différentes études sur les protéines MK-2 et TTP (Chrestensen et al., 2004; Johnson et al., 2002; Stoecklin et al., 2004). De même, il semblerait que la phosphorylation de la kinase p38 favorise la traduction de l’ARNm du TNF-a (Pritchett et al., 1995). Les protéines TIAR et TIA-1 ont, quant à elles, été identifiées comme ARE-BP capables de lier les séquences

ARE de l’ARNm du TNF-a. Si l’invalidation du gène tia-1 a permis de montrer que la protéine

exerce une répression traductionnelle sur l’ARNm du TNF-a (Piecyk et al., 2000), aucune donnée n’a jusqu’à présent été présentée dans la littérature concernant la fonction de la protéine TIAR dans le métabolisme du TNF-a. D’autre part, aucun élément ne permet de confirmer ou d’infirmer l’existence d’une influence de la voie de signalisation p38 sur les protéines TIAR et TIA-1 ou réciproquement.

Nous avons dans ce travail caractérisé la fonction de la liaison de la protéine TIAR aux ARE de l’ARNm du TNF-a et l’effet qu’exerce TIAR sur la synthèse de TNF-a en réponse au LPS. Nous avons montré qu’outre l’existence d’un effet inhibiteur direct sur la production de TNF-a, la protéine TIAR régule la voie de signalisation aboutissant à la synthèse de cette cytokine en modulant l’expression de la phosphatase MKP-1. Nous avons donc, pour la première fois, mis en évidence l’existence d’une connexion entre la voie de signalisation impliquant la MAPK p38 et l’ARE-BP TIAR.

1.1) Analyse des transcriptomes de cellules RAW 264.7 surexprimant TIAR-Flag ou

TIARARRM2

L’analyse globale par puces à ADN des transcriptomes de cellules RAW 264.7 surexprimant TIAR-Flag et stimulées ou non par le LPS nous a permis de montrer que dans ces deux

conditions, la protéine TIAR joue essentiellement un rôle de répresseur sur l’expression des ARNm modulés par sa surexpression. Bien que ces effets soient majoritairement indirects, la protéine TIAR-Flag n’immunoprécipitant pas la plupart des ARNm modulés par sa surexpression, il est intéressant de constater que TIAR exerce aussi un effet positif sur l’expression de certains gènes. En absence de stimulation des cellules RAW 264.7, l’analyse ontologique révèle que cet effet activateur de l’expression des gènes concerne des groupes fonctionnels directement liés à la réponse immune (00:0006955 réponse immune; 00:0019882 préparation et présentation des antigènes; 00:0009607 réponse aux stimuli biotiques). Au contraire, aucun groupe fonctionnel lié à la réponse immune ne semble affecté positivement par une surexpression de TIAR en condition de stimulation par le LPS. Cette observation semble corrélée avec l’analyse quantitative du nombre de gènes modulés positivement par une surexpression de TIAR en absence de stimulation ou en réponse au LPS. La proportion de gènes régulés positivement chute en effet de 35,1% en absence de stimulation à 18,6% en condition de stimulation par le LPS. Il est a noter également qu’en absence de stimulation, les termes « 00:0006955 réponse immune » et « 00:0009607 réponse aux stimuli biotiques » sont plus enrichis parmi les gènes dont l’expression augmente suite à une surexpression de la protéine TIAR que parmi les gènes dont l’expression diminue (31 gènes associés au terme 00:0006955 en absence de stimulation contre 17 en condition de stimulation par le LPS; 18 gènes associés au terme 00:0009607 en absence de stimulation contre 8 en condition de stimulation par le LPS). La capacité de la protéine TIAR à réguler positivement l’expression de gènes associés à la réponse immune semble complètement disparaître après 2h de stimulation par le LPS, laissant la place à une fonction exclusivement répressive. Ces résultats suggèrent qu’en absence de stimulation, la protéine TIAR pourrait jouer un rôle plus subtil en équilibrant l’initiation de la réponse immune par un jeu de régulations impliquant à la fois la répression et l’activation des gènes dont elle contrôle l’expression.

Les effets observés lors de la surexpression de la protéine TIARARRM2 sont, quant à eux, difficilement interprétables, tant d’un point de vue quantitatif que qualitatif. L’absence de domaine RRM2 pourrait effectivement induire un gain de fonction chez la protéine mutante par rapport à la protéine entière. Des études montrent en effet que des mutations dans les domaines RRM peuvent augmenter leur affinité pour certaines séquences. C’est le cas, par exemple, pour la protéine hnRNP Al (Myers et al., 2004) et la protéine U1A (Benitex et al., 2007), deux protéines

à domaines RRM dont les mécanismes de liaison à l’ARN ont été étudiés par mutations ponctuelles. 11 semblerait en effet que les phénomènes d’encombrement stérique et les répulsions électrostatiques entre les nucléotides de TARN et certains acides aminés des domaines RRM soient essentiels pour assurer une spécificité de liaison à la protéine. Dès lors, il est tout à fait envisageable que la désorganisation des domaines de liaison à TARN de la protéine TIAR permette à la protéine mutante de fixer des ARNm qui ne sont normalement pas liés par la protéine entière. Nous avons d’ailleurs été surpris de constater que 200 ARNm présents dans le culot de l’IP T1ARARRM2 en condition de stimulation par le LPS ne soient pas îmmunoprécipités par la protéine entière dans les mêmes conditions. La présence de ces ARNm exclusivement dans le culot de l’IP T1ARARRM2 suggère fortement que le mutant ait pu perdre la spécificité de liaison de la protéine entière. Par conséquent, les effets résultant de cette spécificité de liaison nouvellement acquise ne seraient par relevant d’un point de vue physiologique. De fait, les gènes dont l’expression est exclusivement modulée par la protéine TIARARRM2 ne peuvent être considérés comme des candidats sérieux. Néanmoins, l’analyse des transcriptomes de RAW 264.7 surexprimant la protéine T1ARARRM2 nous a permis de mettre en évidence l’importance du domaine RRM2 dans la régulation d’un grand nombre de gènes par la protéine TIAR entière. Les effets observés dans les cellules surexprimant TIAR-Flag sur 87% des gènes en absence de stimulation et 52% après stimulation par le LPS sont