Etude de la fonction de la protéine TIAR in vivo

2.1) Profil d’expression du pBap-GFPlox-TIARflas 3 ’

L’analyse du profil d’expression de la GFP par western blot montre une expression du transgène restreinte aux testicules. Seule la lignée y présente une faible expression du transgène dans les muscles squelettiques et dans le cerveau (voir annexe 4, figure 2). Nous suspectons fortement que la taille de la collection de transgènes soit en partie responsable de l’extinction de son expression dans les cellules somatiques. Plusieurs arguments nous permettent d’émettre cettefiypothèse : •

• Les lignées a et P présentent exactement le même profil d’expression. Par conséquent, il

est peu probable que la restriction de l’expression du transgène soit liée à un effet de positionnement chromosomique.

• Nous avons pu détecter la présence de l’ARNm de la GFP dans les muscles squelettiques

et le cerveau d’individus de la lignée y (voir annexe 4, figure 2). Or, cette lignée présente une collection de transgènes nettement moins importante que les lignées a et p.

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• Le profil d’expression identique des transgènes pBap-HuR, pBap-GFPlox-HuR et

pBap-GFPlox-TIARflag 3 ’ met les séquences codant pour la GFP, TIAR ou HuR hors de cause

dans l’expression restreinte aux testicules. De même, l’expression du transgène

pBap-AUFl ne permet pas de conclure à un problème lié à l’utilisation du promoteur de la P-

actine humaine en lignée murine. En outre, le laboratoire de l’IRlBHM Gosselies a généré une souris avec la même construction, contenant cette fois la séquence codant pour la protéine SKIP et présentant aussi une expression restreinte aux testicules (informations

aimablement communiquées par Eileen Pemot). La collection de transgène

pBap-GFPlox-SKlP contenait aussi un nombre élevé de copies du transgène.

• Différentes études démontrent l’existence d’une corrélation entre la taille d’une collection

de transgènes et son taux de méthylation (Methali et al., 1991; Garrick et al., 1998). Bien qu’il semblerait qu’en fonction du locus d’intégration du transgène, cette règle ne soit pas toujours vraie et qu’une diminution du nombre de copies du transgène puisse induire une importante variation d’expression au sein d’un même individu (Williams et al., 2008), ce phénomène d’extinction de l’expression nous semble probable.

Une autre possibilité réside dans les mécanismes de régulation transcriptionnelle des protéines TIAR et HuR. Jusqu’à présent, la transcription de ces gènes n’a pas encore été étudiée. 11 est envisageable que certaines séquences régulatrices présentes dans les introns de ces gènes, voire au niveau du promoteur qui les contrôle, soient nécessaires pour éviter une méthylation de ces gènes. Par conséquent, l’absence d’intron dans le transgène ou l’utilisation d’un promoteur autre que le promoteur endogène de ces deux gènes pourrait expliquer cette expression restreinte aux tissus germinaux et embryonnaires.

2.2) Génération de souris surexprimant la protéine TIAR dans les cellules de la lignée

hématopoïétique

Bien que le promoteur Vav soit décrit comme efficace pour activer l’expression de la recombinase Cre dans les cellules de la lignée hématopoïétique (Georgiades et al., 2002; de Boer et al., 2003), nous ne sommes pas parvenus à générer de souris surexprimant la protéine TIAR dans ces types cellulaires par croisement des individus transgéniques des lignées P ou y avec les

— - -

--souris Vav-Cre. La littérature contient peu d’informations concernant ces souris et l’efficacité

d’excision de la recombinase Cre in vivo. Une première équipe de chercheurs a utilisé les souris

Vav-Cre pour induire l’expression de leur transgène. Celui-ci avait précédemment été cloné dans un chromosome artificiel bactérien (BAC) qui fut ensuite utilisé pour générer les souris

transgéniques (Tiedt et al., 2008). Deux autres équipes ont, quant à elles, utilisé les souris

Vav-Cre pour invalider un gène (Daria et al., 2008; Ananieva et al., 2008). Dans tous les cas,

l’utilisation de la recombinase Cre était destinée à exciser ou inversertine séquence présente dans le génome en un unique exemplaire. Si l’utilisation de ces souris semble avoir bien fonctionné pour ces trois études, nous ne savons pas comment se comporte la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur Vav en présence d’une collection contenant plusieurs copies d’un transgène. 11 se pourrait que l’utilisation du promoteur Vav ne permette pas une expression assez forte de la recombinase Cre pour induire une recombinaison efficace d’une collection composée d’un nombre important de copies du transgène.

Bien que la recombinase Cre semble activer l’expression de la GFP dans le thymus et les testicules de certaines souris GFP-TIAR/Fov-Cre^, aucune expression de la protéine TIAR-Flag n’a pu être détectée dans les mêmes tissus. Nous avons aussi constaté l’absence d’expression de la protéine TIAR-Flag dans la rate et dans des cellules dérivées de la moelle osseuse de ces mêmes individus (données non présentées). D’une part, ces observations suggèrent une variabilité dans les effets de la recombinase Cre sur l’expression du transgène. D’autre part, elles révèlent l’incapacité de la recombinase Cre à activer l’expression de la protéine TIAR-Flag dans les cellules germinales et hématopoïétiques.

2.3) Génération de souris surexprimant la protéine TIAR-Flag à un stade précoce du

développement embryonnaire

Lors de son travail de thèse, Françoise Rothé avait déjà montré, en collaboration avec le

laboratoire d’Embryologie Moléculaire du Professeur Eric Bellefroid, que le gène tiar est

exprimé tout au long du développement embryonnaire chez le xénope (F. Rothé, Thèse 2006). En

et al., 1998). Au cours de mon travail de mémoire au sein du laboratoire de Biologie Moléculaire du gène, nous avions tenté de générer des souris surexprimant la protéine TIAR de manière

ubiquiste à l’aide du transgène pBap-TIARJÎag 3’. Malgré les nombreuses campagnes de

transgenèse réalisées par le service de transgenèse de l’Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS) de Toulouse, aucune souris transgénique n’a été obtenue. Ces résultats suggéraient déjà fortement une létalité embryonnaire liée à la surexpression du transgène. L’analyse d’une létalité embryonnaire liée à un transgène est délicate à mener. Elle nécessite en

effet la génération de novo d’embryons transgéniques surexprimant la protéine d’intérêt par la

méthode de transgenèse par addition. Cette technique est relativement lourde à mettre en place et l’établissement de lignées surexprimant la protéine TIAR de manière conditionnelle par croisement avec des individus transgéniques exprimant la recombinase Cre très tôt au cours du développement embryonnaire (Lallemand et al., 1998) nous a permis de contourner les difficultés à analyser ce phénotype.

Néanmoins, cette stratégie a donné des résultats inattendus. En effet, si la transmission non mendéleenne du transgène a confirmé qu’une surexpression de la protéine TIAR au cours du développement embryonnaire est létale, l’existence de « survivants » transgéniques nous a permis de constater une variabilité assez importante de l’expression de la protéine TIAR-Flag après recombinaison du transgène par la recombinase Cre. La présence d’individus GFP-TIAR'^’’ et GFP-TIAR^* au sein d’une même portée témoigne que ces différences d’expression sont dues à la variabilité d’efficacité de recombinaison du transgène par la recombinase Cre. Par conséquent, les croisements entre les femelles Pgk-Cre et les mâles GFP-TIAR, que ceux-ci soient issus de la lignée a ou P, génèrent une population hétérogène d’individus exprimant TIAR à des degrés différents. Le niveau d’expression de la protéine semble corrélé au nombre de copies de la séquence codant pour la protéine TIAR encore présentes après recombinaison par la recombinase Cre. Ce résultat suggère fortement que la létalité embryonnaire liée à la protéine TIAR-Flag puisse ne se manifester qu’au-delà d’un certain taux d’expression. Bien que ces observations semblent contredire l’hypothèse selon laquelle un nombre de copies important du transgène puisse induire une extinction de son expression dans les cellules somatiques, il faut garder à l’esprit que les phénomènes de méthylation de l’ADN ne prennent place qu’à partir du stade E13 au cours du développement embryonnaire et que les tissus germinaux présentent un profil de

méthylation de leurs gènes tout à fait particulier (pour revue: da Rocha et al., 2004). Par conséquent, une absence d’expression dans les cellules somatiques, liée à une taille importante d’une collection de transgènes, n’est pas incompatible avec l’observation d’une augmentation de l’expression du transgène corrélée positivement avec le nombre de copies de celui-ci dans les cellules germinales et embryonnaires.

Nous avons montré que la létalité embryonnaire due à une expression anormale de TIAR prend place de manière précoce au cours du développement embryonnaire. En effet, les embryons Pgk-

Cre X GFP-TIAR se développent normalement jusqu’au 6® Jour après la fécondation lorsque leur

développement a lieu in utero. Au-delà de ce stade, nos résultats indiquent qu’une expression

anormale de la protéine TIAR n’est pas compatible avec le développement de l’embryon. De manière intéressante, nous avons constaté que les embryons Pgk-Cre x GFP-TIAR se développent correctement jusqu’au stade blastocyste quand ils sont cultivés dans le milieu G2. Cependant, ils ne parviennent plus à ce stade lorsqu’ils sont cultivés dans le milieu Ml6. Nous en avons conclu que l’expression anormale de la protéine TIAR dans ces embryons les sensibilise de manière importante aux conditions de culture, le milieu Ml6 n’étant pas optimal pour leur développement. On peut supposer dès lors que leur culture dans ce milieu induit un stress cellulaire qui provoque une létalité plus élevée chez les embryons transgéniques. De manière particulièrement intéressante, la culture dans le milieu Ml6 d’embryons de souris prélevés entre les stades El.5 et E3.5 induit un fort taux de phosphorylation des kinases SAPK et p38 (Wang et al., 2005). En outre, de nombreuses études ont montré que les protéines de stress et notamment la voie de signalisation de la MAPK p38 jouent un rôle essentiel dans le développement embryonnaire pré-implantatoire (Pour revue; Rappolee, 2007; Xie et al., 2008). L’une d’entre elles montre que des embryons de souris cultivés à partir du stade 1 à 8 cellules dans le milieu M16 et traités avec la drogue SB203580, un inhibiteur spécifique de la MAPK p38, se développent en blastocystes dépourvus de blastocoele et dégénèrent rapidement (Maekawa et al., 2005). Etant donné le rôle attribué aux protéines TIAR et TIA-1 dans le contrôle de la traduction au cours de la réponse au stress dans les cellules somatiques et sa capacité à se localiser dans les granules de stress (Mazan-Mamczarz et al., 2005; Pour revue; Anderson et al., 2002), il est probable que l’expression anormale de la protéine TIAR soit responsable d’une réponse au stress déficiente chez les embryons transgéniques GFP-TIAR cultivés dans le milieu Ml6. Ainsi, nous

envisageons d’examiner la localisation et l’accumulation de la protéine TIAR dans des embryons.WT x GFP-TIAR ou Pgk-Cre x GFP-TIAR cultivés dans le milieu M16 ou le milieu G2 depuis le stade 1 à 8 cellules jusqu’au stade blastocyste Beck et al. ont montré que des cellules souches embryonnaires (ES) dérivées de cellules primordiales germinales de souris

invalidées pour le gène tiar nécessitent aussi des conditions de cultures optimales pour pouvoir

croître normalement in vitro (Beck et al. 1998). Dans le cas de ces cellules, c’est la présence de la

cytokine LIF (leukemia inhibitory factor) dans le milieu qui conditionne la croissance des ES

tiar''. In vivo, il a été démontré par invalidation du gène lif que cette cytokine est indispensable

pour permettre l’implantation du blastocyste (Stewart et al., 1992). Les femelles lif'' sont fertiles

mais l’absence de la cytokine LIF rend la paroi utérine non réceptive au blastocyste et la décidua ne se forme pas, empêchant l’embryon de s’implanter (Chen et al., 2000). Cette cytokine est présente dans le milieu utérin tout au long du développement embryonnaire et les embryons expriment très tôt son récepteur, le LIFR (Leukemia inhibitory factor receptor) (Nichols et al., 1996). Chez l’embryon, il semblerait que le LIF soit responsable de l’activation de la cascade Jak/Stat (respectivement Janus kinase et Signal Transducer and Activators of Transcription) nécessaire à la différenciation du trophectoderme de l’embryon qui prend place au moment de l’implantation (Takahashi et al, 2008). De manière particulièrement intéressante, cette voie de signalisation est régulée négativement par les protéines SOCS 1 et SOCS 3 (supressor of cytokine signal) (Starr et al., 1997) dont nous avons pu montrer par la méthode RIP-Chip que leurs ARNm étaient enrichis jusqu’à 8 fois dans le culot de l’IP TIAR-Flag réalisé sur des extraits de cellules RAW 264.7 (voir annexe 3.3 a et b). La surexpression de la protéine TIAR pourrait ainsi contribuer à déréguler des voies de signalisation indispensables au développement de l’embryon

in vivo.