1.1 Activité killer
Parmi les toxines killer produites par l’espèce S. cerevisiae, le groupe K2 est le plus largement représenté dans les conditions œnologiques (Young, 1987). Le but de cette expérience est donc d’évaluer le caractère killer K2 de l’espèce T. delbruekii afin de voir si la croissance de cette espèce est « compatible » avec celle de l’espèce S. cerevisiae. En effet, bien que le véritable rôle des toxines killer au cours de la fermentation alcoolique soit discuté (Ribéreau-Gayon et al., 2004), il est indispensable de prendre ce facteur en compte pour réaliser des co-inoculations entre ces 2 espèces.
Les 17 souches testées au cours de cette expérience sont toutes résistantes à la levure killer S. cerevisiae (CLIB 154, toxine killer K2) mais incapables de tuer la levure S. cerevisiae sensible (X2180, sensible à la toxine killer K2). Elles sont donc considérées comme neutres vis-à-vis de la toxine killer K2.
Ces résultats sont en accord avec Heard et Fleet (1987) qui ont aussi décrit une souche de T. delbrueckii comme étant neutre vis-à-vis de cette toxine. Par ailleurs, nous n’avons testé
qu’une des nombreuses toxines potentiellement produites. D’autres essais pourraient être menés afin de connaître la sensibilité de T. delbrueckii aux autres toxines produites par les levures Saccharomyces mais aussi non-Saccharomyces. En effet, des travaux ont révélé la sensibilité de T. delbrueckii à l'activité killer de certaines souches appartenant aux genres Pichia et Kluyveromyces(Yap et al., 2000).
1.2 Production de sulfure d’hydrogène (H
2S)
Le sulfure d’hydrogène (H2S) est un composé soufré indésirable dans le vin car il donne des arômes d’œuf cuit et a un seuil de perception très faible : 10 à 100 µg/L selon les vins (Lambrecht et Pretorius 2000). Sa production peut être sensiblement augmentée lors de la fermentation de moût pauvre en azote.
La production de sulfure d’H2S a été évaluée pour 27 souches de T. delbrueckii en utilisant le milieu Biggy agar. Ce milieu contient des ions bismuth qui réagissent avec H2S en formant un précipité brun qui rend possible l’évaluation visuelle de la production d’H2S par la coloration des colonies. En effet, l’intensité de la coloration est étroitement corrélée à la quantité d’H2S produite (liée à l’activité sulfite réductase des levures) donc plus les colonies sont foncées plus elles ont produit d’H2S (Jiranek et al., 1995).
Dans ces conditions, les 27 souches de T. delbrueckii testées présentent une production modérée et similaire d’H2S de niveau 3 sur l’échelle visuelle Biggy (allant de 1 à 5) exceptée la souche IFR5 qui présente une production de niveau 4. Dans les mêmes conditions, Jiranek et al. (1995) ont trouvé une plus grande variabilité au sein de l’espèce S. cerevisiae en utilisant 19 souches classées de faibles à fortes productrices.
1.3 Production de phénols volatils
Certaines espèces de levure sont associées à la production de composés à défaut olfactif : les phénols volatils. Ils sont formés à partir des acides phénoliques contenus dans le vin. Ainsi, une première enzyme, la cinnamate décarboxylase, permet la transformation de l’acide para-coumarique en phénol (gouache, caoutchouc brûlé) et de l’acide férullique en 4-vinyl-gaïacol (clou de girofle, amande grillée). Ces deux composés sont cependant peu odorants. Les composés les plus désagréables sont le phénol (cuir, écurie, encre) et le 4-éthyl-gaïacol (épice, caramel brûlé). Ils sont formés respectivement à partir du 4-vinyl-phénol et du 4-vinyl-gaïacol par l’intermédiaire d’une enzyme que l’on retrouve principalement chez les
espèces du genre Brettanomyces (Dekkera), la vinyl-phénol réductase (Chatonnet et al., 1992, 1995).
Dans cette expérience, 28 souches de T. delbrueckii ont été testées en duplicata pour leur production de phénols volatils, représentée par la somme du 4-vinyl-phenol, 4-vinyl-gaïacol, 4-éthyl-phenol et 4-éthyl-gaïacol. Cette production a été comparée à celle de deux souches de S. cerevisiae : VL1, une souche faiblement productrice (Chatonnet et al., 1993) et ST une souche productrice.
Dans nos conditions, le témoin positif S. cerevisiae ST a produit 27 ± 4,9 mg/L de phénols volatils alors que la production par le témoin négatif S. cerevisiae VL1 est environ dix fois inférieure soit 2,6 ± 0,1 mg/L. Les souches de T. delbrueckii ont produit de très faibles quantités de phénols volatils dont aucune production d’éthyl-phénol (éthyl-phenol et 4-éthyl-gaïacol). Les concentrations varient entre 0,1 et 2,9 mg/L selon les souches (variabilité intraspécifique), avec une production moyenne de 2,1 ± 0,8 mg/L (figure 16) inférieure à la souche VL1 considérée comme une faible productrice. Seules 6 souches ont une production légèrement supérieure à celle de VL1 (de 4,5 à 11% de plus). Cependant, la production des différentes T. delbrueckii est toujours très inférieure à celle du témoin positif : de 9 à 270 fois moins.
Figure 16 : Concentrations en phénols volatils pour 28 souches de T. delbrueckii et 2 S. cerevisiae (VL1 : POF- et ST : POF+). Moyenne de 2 répétitions.
Les 28 souches de T. delbrueckii sont décrites dans le tableau ci-dessous.
0 5 10 15 20 25 30 35 POF+ POF- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 P h é n o ls v o la ti ls ( m g /L ) S. cerevisiae T. delbrueckii
Toutes les souches de T. delbrueckii présentent donc une très faible production de phénols volatils relative à une faible activité cinnamate décarboxylase, permettant la transformation des acides phénoliques en vinyl-phénols, et une absence d’activité vinyl-phénol réductase conduisant à la formation d’éthyl-phénol (molécules à défauts olfactif très désagréables). Ces résultats sont en accord avec Shinohara et al. (2000) qui ont décrit une souche de cette espèce comme une faible productrice de phénols volatils.
1.4 Croissance à différentes températures
La capacité des levures à se développer est un facteur très important pour réaliser la fermentation alcoolique dans de bonnes conditions.
La croissance de 18 souches de T. delbrueckii à trois températures différentes a été évaluée selon la méthode mise au point par Antunovics et al. (2005) légèrement modifiée. Les tests sont réalisés sur un milieu YPD liquide inoculé à 0,1 de DO mesurée à 590 nm, à partir des pré-cultures de 24h à 24°C réalisées sur le même milieu. La croissance des souches est évaluée par la mesure de la DO à 590 nm après une durée de 72h à 10°C, 24h à 26°C et 10h à 37°C. Deux souches de S. cerevisiae ont également été testées. Les résultats sont rapportés sur la figure 17 et correspondent au rapport DO590 finale/DO590 initiale.
A 10°C après 72h, on observe une variabilité intraspécifique importante au sein de l’espèce T. delbrueckii avec des rapports compris entre 8,7 et 48,1 (différences significatives). L’augmentation moyenne de la densité optique de 23,2 ± 9,9, est légèrement supérieure à la valeur moyenne obtenue pour les deux souches de S. cerevisiae soit 19,7 ± 0,5 mais n’est pas significativement différente entre les 2 espèces.
Codes Souches Codes Souches
1 CLIB 503 15 OXT1 2//3 2 CLIB 504 16 OXT5 6//3 3 CLIB 505 17 POM J2 4 CLIB 506 18 GI1 5 CLIB 507 19 A2 6 CLIB 230 20 B8 7 31703 21 C7 8 27828 22 D7 9 CBm621 23 E7 10 Lm1T10 24 7013 11 Lm1T20 25 IFR 5 12 Lm2T7 26 IFR 7
13 OXT1 1//2 27 AN04 Y01
La distribution du paramètre croissance est encore plus grande à 26°C (différences significatives entre souches), avec un minimum de 12,9 et un maximum de 62,8 selon les souches. L’augmentation de la croissance moyenne pour l’espèce T. delbrueckii, 39,2 ± 9,8 est significativement plus faible que celle de S. cerevisiae, 50,2 ± 3,9.
La croissance moyenne après 10h à 37°C est quasiment nulle puisqu’elle est de 1,27 ± 0,3 et est significativement inférieure à celle de S. cerevisiae 5,4 ± 1,1. Les croissances des différentes souches de T. delbrueckii varient de 0,9 à 1,8 et présentent, bien que les valeurs soient très faibles, des différences significatives. Ce résultat souligne une thermosensibilité plus importante de l’espèce T. delbrueckii par rapport à l’espèce S. cerevisiae.
Figure 17 : Augmentation de la densité optique (D.O.590f / D.O.590i) à 10°C, 26°C et 37°C pour 16 souches de T. delbrueckii.
Finalement, ces résultats nous montrent, d’une part, que l’espèce T. delbrueckii présente une variabilité intraspécifique importante au niveau de sa croissance pour les 3 températures différentes et d’autre part que cette espèce est caractérisée par des aptitudes de croissance à 26°C supérieures à celles à 10°C et quasiment nulles à 37°C soulignant sa thermosensibilité. Ces aptitudes de croissance sont similaires à celle de S. cerevisiae à 10°C mais inférieures à 26 et 37°C. 0 10 20 30 40 50 60 70 10°C 26°C 37°C D O f in a le / D O i n it ia le Q1 min médiane max Q3