Extraction du glycérol interne

Nous avons mis au point un protocole d’extraction du glycérol interne en modifiant légèrement le protocole pour l’extraction des métabolites internes par lyse cellulaire que nous a fourni le Professeur Michel Rigoulet travaillant à l’Institut de Biochimie et Génétique Cellulaire (IBGC) CNRS UMR 5095 à Bordeaux.

La première étape consiste à centrifuger (centrifugeuse Sigma 3-16K) à 6000 rpm, pendant 5 minutes à 4°C, un volume du milieu en fermentation pour obtenir un culot cellulaire correspondant à un extrait sec de 80 mg de matière sèche. Le volume à prélever est évalué en se rapportant aux gammes de concentration cellulaire en fonction de la matière sèche préalablement établies pour chaque souche. Le culot est ensuite mis en contact avec 4 mL d’un mélange méthanol/tampon HEPES 175 mM (60/40 v/v) à -80°C, ce qui permet de bloquer le métabolisme des levures et d’éviter une fuite du glycérol intracellulaire dans le milieu extérieur (Gonzalez et al., 1997). Le culot, remis en suspension dans le tampon, est alors transféré dans un tube de 5 ml puis centrifugé à 6000 rpm pendant 5 min. Le surnageant est alors retiré. Il est important de rester à 4°C pendant toute la suite de l’expérience. 500 µ L d’acide perchlorique 1M sont alors additionnés au culot qui est transféré dans un tube Fastprep contenant 1g de billes de 0,5 à 0,6 µm de diamètre. Les tubes sont alors agités par l’appareil FastPrep^TM FP120 (Bio 101, ST Quentin en Yvelines, France) : 5 cycles de 45s à 6,5 m/s en remettant les tubes dans la glace entre chaque cycle. Après avoir vérifié au microscope (Novex-Holland, B-series, Pays-Bas) l’efficacité de la lyse cellulaire, 500 µ L d’acide perchlorique 1M sont ajoutés, puis les tubes sont agités à l’aide d’un vortex et 850 µL de surnageant prélevés après centrifugation à 12000 rpm pendant 5 mn. Le surnageant est alors transféré dans un tube Eppendorf et 40 µl de Thymol Blue et 200 µl de K2CO3 (5M) sont ajoutés. Après 15 minutes et une centrifugation à 12000 rpm pendant 2 mn, 900 µl de surnageant sont prélevés et 40 µl de Tris-HCL 2M sont ajoutés. Le pH est ensuite ajusté entre 6,8 et 7, par ajout de 50 µ L d’HCl 1M, et les tubes sont congelés à -20°C jusqu’à analyse. Le dosage du glycérol, contenu dans les extraits cellulaires, est ensuite réalisé au laboratoire SARCO, selon la méthode enzymatique décrite précédemment (Chapitre VII.3, partie Matériels et Méthodes).

IX Analyse statistique

L’analyse statistique non paramétrique permet d’étudier les données issues de nombreuses populations différentes mais de petites tailles (< 30 échantillons), comme c’est le cas dans notre étude. Ainsi, nous avons utilisé des tests non-paramétriques basés sur l’étude des rangs. Le premier (équivalent non-paramétrique de l’ANOVA à un facteur) est appelé « ANOVA with general scores » (α < 0,05) et permet de comparer les souches de T. delbrueckii entre elles, le second (équivalent non-paramétrique du test de Student) est appelé « Normal scores » et permet de comparer la population T. delbrueckii à la population S. cerevisiae (α < 0,05). Ces deux tests sont réalisés grâce au logiciel Statxact (Cytel studio).

Tous les autres tests ont été réalisés en utilisant le logiciel R-software Rcdmr pack (www.R-project.com). Les tests suivants sont des tests statistiques classiques (paramétriques) et sont réalisés après avoir vérifié la normalité de la distribution par le test de Shapiro-Wilk (α < 0,05). Les valeurs d’acidité volatile et de glycérol ont été soumises à une analyse de variance à deux facteurs (α < 0,05), tandis que l’étude de la corrélation entre 2 paramètres est évaluée par l’analyse de la régression linéaire (test de Spearman α < 0,05).

Le traitement des tests de dégustation triangulaires, réalisés pour comparer 2 types de vins, est fondé sur la loi binomiale (1/3) (Norme NF V09-013).

Résultats et Discussion

Afin d’évaluer le potentiel « œnologique » de l’espèce Torulaspora delbrueckii, nous avons réalisé une étude à partir d’une collection d’environ 30 souches. Cependant, le nombre de souches de T. delbrueckii disponibles pour effectuer les diverses expériences a évolué au cours des trois années de thèse. En effet, une quinzaine de souches étaient disponibles à l’origine, pour atteindre trente à l’heure actuelle, expliquant le fait que les souches ne sont pas toujours les mêmes selon les expériences. De plus, lors des dernières expériences, nous avons préférentiellement utilisé les souches faisant partie de la collection IOEB dans l’objectif d’en sélectionner certaines dans un but commercial.

La première partie de ce travail a consisté à comparer différentes méthodes de biologie moléculaires, utilisées pour la caractérisation génétique des souches de différentes espèces non-Saccharomyces, afin de voir si elles sont applicables à l’identification au niveau souche de l’espèce T. delbrueckii. En effet, aucune méthode de typage n’a été proposée, à notre connaissance, pour différencier les souches de cette espèce. Ensuite, dans une deuxième partie, pour caractériser l’espèce T. delbrueckii d’un point de vue phénotypique, nous avons repris un grand nombre de tests habituellement réalisés pour la sélection des souches de S. cerevisiae, espèce majoritairement commercialisée. T. delbrueckii étant caractérisée par une faible production d’acidité volatile, particulièrement en conditions hyperosmotiques, nous nous sommes intéressés, dans une troisième partie, à ses mécanismes de réponse au stress osmotique. Dans une quatrième partie, afin d’évaluer l’intérêt œnologique de cette espèce dans des conditions proches de celles des vinificateurs, nous avons réalisé des co-inoculations avec S. cerevisiae dans des moûts naturels avec les souches les plus performantes identifiées lors de la caractérisation phénotypique. Ce travail nous a amené à mettre au point un outil indispensable à l’étude des interactions entre levures : un fermenteur à double compartiment qui sera présenté dans une cinquième et dernière partie.

I Identification génétique des souches de T. delbrueckii

Afin de pouvoir différencier les souches de T. delbrueckii, nous avons évalué plusieurs méthodes utilisées au laboratoire pour la caractérisation génétique des souches de diverses espèces de levures non-Saccharomyces mais jamais utilisées, à notre connaissance, pour la différenciation des souches de l’espèce T. delbrueckii. Ce travail a été réalisé avec Cécile Miot-Sertier (ISVV).

Deux approches techniques ont été utilisées : la PCR et la REA-PFGE. Les résultats obtenus pour 21 souches de T. delbrueckii testées sont résumés dans le tableau 7.

Tableau 7 : Profils génétiques obtenus par PCR RAPD, PCR Fingerprinting et REA-PFGE.

Les profils génétiques identiques sont représentés par un numéro identique. Deux souches sont différentes si leurs profils sont différents pour au moins une bande.

L’approche PCR consiste à combiner les résultats obtenus par plusieurs PCR déjà décrites pour l’identification de souches non-Saccharomyces (Koscube et al., 2007 ; Pinto et al., 2004). Ainsi, 5 PCR RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) et 2 PCR Fingerprinting avec amorces microsatellites ont été utilisées. L’analyse RAPD permet de diviser les souches en 9, 7, 8, 7 et 3 groupes différents pour les amorces M13, M14, OPA02, Coc et OPA09, respectivement. Les PCR Fingerprinting avec les amorces (GAC)5 et (GTG)5, donnent respectivement 5 et 4 groupes différents. La combinaison de ces 7 méthodes PCR permet la séparation des 21 souches en 18 groupes.

La seconde approche est la REA (Restriction Endonuclease Analysis) de l’ADN génomique suivie d’une électrophorèse en champ pulsé (PFGE). Cette méthode a été utilisée par Miot-Sertier et Lonvaud-Funel (2007) pour le typage au niveau souche de Brettanomyces bruxellensis. La REA-PFGE avec les enzymes Sfi I et Apa I ont généré des profils de restriction très complexes et impossibles à analyser (données non présentées) contrairement à

Combinaison des REA-PFGE 7 profils PCR

Souches _{M13 M14 OPA02 OPA09 Coc (GAC)5 (GTG)5 Not I}

Lm1T10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Lm2T7 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Lm1T20 3 1 3 3 3 2 3 3 3 GI1 3 3 3 3 3 3 3 4 4 Cbm621 2 1 2 2 2 2 2 5 5 27828 3 3 3 3 3 2 2 6 6 31703 2 2 2 2 3 2 2 7 7 CLIB 230 2 2 2 2 4 2 2 8 8 CLIB 503 2 4 2 2 5 2 2 9 9 CLIB 504 2 2 2 2 3 2 2 10 10 CLIB 505 2 2 2 2 3 2 2 10 10 CLIB 506 4 5 4 2 3 2 2 11 11 CLIB 507 4 5 4 2 3 2 2 11 12 A2 4 5 5 3 6 3 3 12 13 B8 5 5 5 3 6 3 3 13 14 C7 6 6 6 3 6 3 3 14 15 D7 6 6 6 3 6 3 3 14 15 E7 7 5 7 3 7 4 4 15 16 IFR5 8 5 7 3 5 4 4 16 17 IFR7 9 7 7 3 5 4 3 17 18 AN07Y01 7 5 8 3 5 5 3 18 19 avec amorces:

l’enzyme Not I qui a permis d’obtenir des profils analysables (figure 15) permettant la séparation des 21 souches en 19 groupes.

Figure 15 : Profils ADN de 21 souches de T. delbrueckii obtenus par REA-PFGE avec Not I.

Les souches sont codées de A à U (voir tableau ci-dessous) ; MM représente le standard de taille S. cerevisiae YNN295.

Aucune des 2 approches n’a cependant permis de différencier génétiquement les souches CLIB 504 et CLIB 505 d’une part et C7 et D7 d’autre part.

La seconde approche, basée sur la REA-PFGE, s’est révélée plus performante et moins contraignante que l’approche combinant 7 PCR différentes, puisqu’elle permet en une seule expérience la différenciation de 19 souches de T. delbrueckii sur les 21 testées, soit 90 % des souches, contre 18 pour la combinaison des PCR, soit 85% des souches.

Souches Codes Souches Codes

CLIB 230 A 31703 L CLIB 503 B 27828 M CLIB 504 C Cbm621 N CLIB 505 D Lm1T10 O CLIB 506 E Lm2T7 P CLIB 507 F Lm1T20 Q A2 G GI1 R B8 H IFR 5 S C7 I IFR 7 T D7 J AN07 Y01 U E7 K

II Caractérisation phénotypique de l’espèce T. delbrueckii

Afin de caractériser l’espèce T. delbrueckii, nous avons, dans un premier temps, mis en place diverses expériences comprenant des tests sur milieux gélosés et sur milieux spécifiques, puis nous avons évalué leurs caractéristiques fermentaires sur milieux synthétiques mimant la composition d’un moût blanc. L’utilisation de milieux synthétiques nous a paru indispensable pour pouvoir comparer les fermentations entre elles sur une période de trois ans. Plusieurs souches de S. cerevisiae ont, par ailleurs, été utilisées comme témoin pour faciliter l’interprétation des résultats obtenus pour l’espèce T. delbrueckii.

Pour l’analyse statistique des données, nous avons utilisé le test de Spearman (α < 0,05) pour l’étude de la corrélation entre 2 paramètres. Des tests non-paramétriques basés sur l’étude des rangs ont également été utilisés : le premier (équivalent non-paramétrique de l’ANOVA à un facteur) est appelé « ANOVA with general scores » (α < 0,05) et permet de comparer les souches de T. delbrueckii entre elles, le second (équivalent non-paramétrique du test de Student) est appelé « Normal scores » et permet de comparer la population T. delbrueckii à la population S. cerevisiae (α < 0,05).