Tests réalisés en microcytofluorimétrie

L’intégrité membranaire a été évaluée en réalisant le test au rouge neutre en fluorimétrie (λexcitation = 535nm, λémission = 600nm). Le rouge neutre est à la fois un colorant vital ou d’inclusion utilisable en photométrie mais aussi une molécule fluorescence utilisable en microcytofluorimétrie proposée dans l’étude de la viabilité cellulaire par Borenfreund et Puerner en 1985. Le rouge neutre est utilisé préférentiellement dans de nombreuses études multicentriques et est exigé dans les textes de normes de standardisation internationales.

Une solution mère de rouge neutre à 0,4% dans de l’eau distillée est préparée et conservée à l’abri de la lumière. La solution utilisée pour le test est issue d’une dilution de la

solution mère au 1/10 dans du milieu de culture sans SVF. Cette solution est centrifugée à 3500 tours / minute pendant 10 minutes afin d’éliminer les éventuels cristaux de sonde qui pourraient endommager les cellules. Après élimination des produits à tester et rinçage des cellules au PBS, la solution fille de rouge neutre est distribuée dans les puits. La microplaque est placée dans l’incubateur pendant 3 heures afin de laisser le temps à la sonde de se fixer aux lysosomes cellulaires. La solution de rouge neutre en excès est éliminée, les cellules sont rincées au PBS puis une solution de révélation composée d’éthanol absolu (50,6%), d’eau (48,4%) et d’acide acétique glacial (1%) est distribuée dans les puits. Après 15 minutes d’homogénéisation de la coloration sous agitation, la microplaque est lue par le Safire.

• Mesure de la masse mitochondriale

La nonylacridine orange (NAO) est une sonde fluorescente (λexcitation = 490nm, λémission = 530nm) qui pénètre dans les mitochondries de cellules vivantes indépendamment du potentiel transmembranaire mitochondrial et se fixe au niveau de la membrane mitochondriale. Une variation, augmentation ou diminution, du signal de fluorescence traduit une modification de la masse mitochondriale.

Une solution mère de NAO à 0,01M est préparée dans du DMSO. La solution utilisée pour le test est issue d’une dilution de la solution mère au 1/1000 dans du milieu de culture sans SVF. Après élimination des produits à tester et rinçage des cellules au PBS, la solution fille de NAO est distribuée dans les puits. La microplaque est placée dans l’incubateur pendant 30 minutes. La sonde présente dans le surnageant est éliminée par retournement de la plaque, les cellules sont rincées au PBS puis du milieu de culture sans SVF est ajouté afin de permettre le relargage de la NAO en excès pendant 1 heure. Après rinçage des cellules au PBS, une solution de révélation composée d’éthanol absolu (50,6%), d’eau (48,4%) et d’acide acétique glacial (1%) est distribuée dans les puits. Après 15 minutes d’homogénéisation de la coloration sous agitation, la microplaque est lue par le Safire.

• Mesure du potentiel transmembranaire mitochondrial par la rhodamine 123

La rhodamine 123 est une sonde fluorescente (λexcitation = 485nm, λémission = 535nm) qui pénètre dans les mitochondries en fonction du potentiel transmembranaire mitochondrial et se fixe au niveau de la membrane mitochondriale. Une variation,

augmentation ou diminution, du signal de fluorescence traduit une modification de ce potentiel transmembranaire mitochondrial.

Une solution mère de rhodamine 123 à 12,5 mg / mL est préparée dans du DMSO. La solution utilisée pour le test est issue d’une dilution de la solution mère au 1/1250 dans du PBS. Après élimination des produits à tester et rinçage des cellules au PBS, la solution fille de rhodamine 123 est distribuée dans les puits. La microplaque est placée dans l’incubateur pendant 30 minutes. La sonde présente dans le surnageant est éliminée par retournement de la plaque, les cellules sont rincées au PBS puis du milieu de culture sans SVF est ajouté. Après rinçage des cellules au PBS, une solution de révélation composée d’éthanol absolu (50,6%), d’eau (48,4%) et d’acide acétique glacial (1%) est distribuée dans les puits. Après 15 minutes d’homogénéisation de la coloration sous agitation, la microplaque est lue par le Safire.

• Mesure du potentiel transmembranaire mitochondrial par le JC-1

La sonde JC-1 permet de déceler des variations du potentiel transmembranaire mitochondrial. Elle se fixe dans la membrane interne mitochondriale sous forme de monomère lorsque l’activité est basse et émet une fluorescence dans le vert (λexcitation = 485nm, λémission = 520nm). Lorsque l’activité est haute, la sonde se fixe sous forme d’agrégats et émet une fluorescence dans le rouge (λexcitation = 485nm, λémission = 600nm).

Une solution mère de JC-1 à 6,5 mg / mL est préparée dans du DMSO sous agitation. La solution utilisée pour le test est issue d’une dilution de la solution mère au 1/1000 dans du PBS. Après élimination des produits à tester et rinçage des cellules au PBS, la solution fille de JC-1 est distribuée dans les puits. La microplaque est placée dans l’incubateur pendant 15 minutes puis lue par le Safire.

• Mesure de l’activité des caspases 3 et 8

Le dosage fluorimétrique de l’activité des caspases 3 et 8 repose sur le clivage d’un substrat, respectivement l’acétyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-méthyl coumarine et l’acétyl- Ile-Glu-Thr-Asp-7-amino-4-méthyl coumarine, par les caspases activées. Ces substrats contiennent une séquence (DEVD ou IETD) reconnue par les caspases qui la clivent, libérant ainsi une molécule fluorescente, l’amino-méthyl coumarine. La fluorescence ainsi mesurée

est proportionnelle à la quantité amino-méthyl coumarine libérée et donc à l’activité des caspases.

Ce test est réalisé selon le protocole fourni par le fabricant Sigma-Aldrich. • Mesure de la condensation de la chromatine

Le Hoechst 33342 est une sonde fluorescente dans l’UV (λexcitation = 365nm, λémission = 450nm) couramment utilisée pour déterminer le contenu en ADN des cellules. Après avoir franchi la membrane plasmique dans altération, la sonde se fixe sur les séquences riches en bases A-T de l’ADN et émet alors une fluorescence bleue. L’iodure de propidium est un intercalant de l’ADN, comme le Hoechst 33342 et émet une fluorescence rouge. Le Hoechst 33342 marque toutes les cellules, vivantes, apoptose et en nécrose tandis que l’iodure de propidium est exclu des cellules viables et ne marque que les cellules en nécrose beaucoup plus rapidement que le Hoechst 33342. Dans les cellules en apoptose, la condensation de la chromatine induit un effet hyperchrome et bathochrome sur le Hoechst 33342 dont la fluorescence devient plus intense. Il devient ainsi aisé de distinguer quantitativement les cellules vivantes des cellules en apoptose.

Une solution mélange de Hoechst 33342 à 10mg/mL et d’iodure de propidium à 0,5mg/mL est préparée dans du PBS. Après élimination des produits à tester et rinçage des cellules au PBS, la solution est distribuée dans les puits. La microplaque est placée dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 minutes puis lue par le Safire.

Le BaP étant autofluorescent dans l’UV, un autre test de condensation de la chromatine a été utilisé. La sonde Enzo Nuclear ID est fluorescente dans le visible (λexcitation = 488nm, λémission = 520nm) et se lie préférentiellement à la chromatine compactée des cellules en apoptose comparativement aux cellules viables non apoptotiques. Elle permet donc de différencier les cellules viables des cellules en apoptose.

Ce test est réalisé selon le protocole fourni par le fabricant Enzo Life Sciences • Mesure de la perméabilité membranaire via l’activation du récepteur P2X7

Le YO-PRO-1 est une sonde fluorogène (λexcitation = 491nm, λémission = 509nm) de 376DA qui n’entre dans les cellules que si la perméabilité membranaire est altérée via l’ouverture des pores membranaires P2X7. Il s’intercale dans l’ADN et émet une fluorescence.

A partir d’une solution mère de YO-PRO-1 à 1mM dans du DMSO, une solution fille est préparée au 1/500 dans du PBS. Après élimination des produits à tester et rinçage des cellules au PBS, la solution fille de YO-PRO-1 est distribuée dans les puits. La microplaque est placée dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 minutes puis lue par le Safire.

• Mesure de l’activité du cytochrome CYP1A1

La sonde resorufin ethyl ether, ou 7-EROD, permet une mesure catalytique de l’induction des cytochromes CYP1A1 et CYP1B1. Le 7-EROD est transformé par ces cytochromes en résorufine, une molécule fluorescente (λexcitation = 535nm, λémission = 600nm).

Une solution mère de 7-EROD à 2mM est préparée dans du DMSO. La solution utilisée pour le test est issue d’une dilution de la solution mère au 1/1000 dans du milieu de culture contenant 2,5% de SVF. Après élimination des produits à tester et rinçage des cellules au PBS, la solution fille de 7-EROD est distribuée dans les puits. La microplaque est placée dans l’incubateur pendant 6 heures puis lue par le Safire.

• Evaluation des cassures simple brin de l’ADN

Le picogreen est une sonde fluorescente (λexcitation = 460nm, λémission = 540nm) se liant à l’ADN double brin. En cas de cassures simples brin de l’ADN, une diminution du signal de fluorescence de la sonde picogreen est observée.

Après élimination du produit à tester, les cellules ensemencées en plaque 6 puits sont rincées au PBS puis un tampon de lyse est ajouté dans les puits. Les cellules sont ensuite grattées à l’aide d’un grattoir, récupérées dans des tubes à centrifuger puis incubées pendant 30 minutes. Le test est ensuite réalisé selon le protocole fourni par le fabricant Invitrogen. Une détermination de la quantité de protéines est effectuée en parallèle suivant la méthode BCA.

• Mesure du calcium

La sonde Fluo-4 permet la détection du calcium. En effet, sa fluorescence est augmentée quand elle s’y fixe.

• Mesure de la peroxydation lipidique

La sonde C11-bodipy permet de mettre en évidence la peroxydation lipidique. Elle se lie aux membranes biologiques par des interactions hydrophobes fortes, sa moitié comportant les 11 carbones pouvant se lier aux bicouches lipidiques. La sonde est très sensible à l’oxydation. Une fois liée aux membranes, elle peut être oxydée par les radicaux ROO. et RO. et ne plus émettre une fluorescence rouge (λexcitation = 488nm, λémission = 520nm) mais une fluorescence verte (λexcitation = 568nm, λémission = 590nm). Cette sonde est insensible aux modifications du microenvironnement telles que le pH ou la polarité du solvant. De plus, elle est photostable et n’est pas cytotoxique.

Une solution mère de C11-bodipy à 2mM est préparée dans du DMSO. La solution utilisée pour le test est issue d’une dilution de la solution mère au 1/1000 dans du milieu de culture sans SVF. Après élimination des produits à tester et rinçage des cellules au PBS, la solution fille de C11-bodipy est distribuée dans les puits. La microplaque est placée dans l’incubateur pendant 30 minutes afin de laisser le temps à la sonde de se fixer aux lipides. Les cellules sont ensuite rincées au PBS puis incubées avec du milieu de culture sans SVF pendant 30 minutes dans l‘incubateur. La microplaque est ensuite lue par le Safire.