3. RESULTATS
3.1. SELECTION DU MODELE D’ETUDE PLACENTAIRE
• Objectif
Le but de notre travail est dans un premier temps de sélectionner un modèle d’étude de cellules placentaires adapté à l’étude de la toxicité induite par des micropolluants.
• Approche expérimentale
Nous avons étudié la cytotoxicité induite par le BaP sur différents modèles placentaires, la culture primaire de trophoblastes, la lignée cellulaire de trophoblastes BeWo et la lignée de trophoblastes JEG-3, par un test de viabilité cellulaire en microplaque, l’analyse du pic SubG1 en cytométrie en flux et une observation microscopique des tapis cellulaires à confluence.
CULTURE PRIMAIRE DE TROPHOBLASTES
Figure 21. Viabilité cellulaire. Les cellules sont incubées pendant 48 heures avec une gamme de concentrations de BaP ou du chlorure de benzalkonium (BAC) à 0,005µM puis la
viabilité cellulaire est évaluée par un test au rouge neutre en microtitration cytofluorimétrique. *** p < 0.001 vs negative control
La viabilité cellulaire est fixée à 100% en absence de BaP. Le témoin positif de mort cellulaire que nous avons choisi (le conservateur chlorure de benzalkonium BAC) induit une perte conséquente de viabilité cellulaire. A l’inverse, le BaP n’induit aucune perte de viabilité après 48 heures d’incubation sur les cultures primaires de trophoblastes jusqu’à 10µM. Nous avons choisi d’étudier trois concentrations de BaP éloignées les unes des autres d’un facteur 10 afin de couvrir une large gamme de concentrations.
Afin d’étudier plus en détail d’éventuels effets apoptotiques du BaP qui ne sont pas mis en évidence par un test de viabilité cellulaire, nous nous sommes intéressée à une étape irréversible de l’apoptose, la fragmentation de l’ADN, via l’analyse du pic SubG1.
Figure 22. Analyse du pic SubG1. Les cellules sont incubées pendant 48 heures avec du BaP ou de la camptothécine 10µM puis l’ADN des cellules est marqué à l’iodure de propidium et les cellules sont analysées en cytométrie en flux. Le pourcentage de cellules en
SubG1 est déterminé par le pourcentage de cellules détectées sous le trait rouge Ces résultats sont représentatifs de 2 expérimentations.
Le BaP n’induit pas l’apparition d’un pic subG1 après 48 heures d’incubation et ne semble donc pas induire de mécanisme apoptotique. Après incubation avec la camptothécine, 90,5% de la population cellulaire ont leur ADN fragmenté.
Les cultures primaires de trophoblastes semblent être un modèle pertinent et intéressant puisqu’il répond aux agents toxiques testés (BAC et camptothécine) et ces cellules montrent des réponses cellulaires différentes de celles auxquelles nous pouvions nous attendre avec le BaP. En effet, dans la littérature, il apparait que le BaP induit la mort cellulaire aux concentrations que nous avons testées sur d’autres modèles cellulaires (Chang et al. 2007). Bien que les cultures primaires de trophoblastes pourraient être intéressantes pour étudier les effets toxiques de micropolluants, les difficultés d’obtention hospitalière de placentas et donc de cultures primaires de trophoblastes rendent difficile l’utilisation de ce modèle cellulaire en routine. De plus, il faut également prendre en compte la variabilité interindividuelle qui peut influencer l’obtention de résultats reproductibles pour la suite des expériences. Un autre paramètre important à prendre en compte est le fait que nous voulons mettre en évidence des biomarqueurs induits par le BaP et le DEHP à des temps longs, pour se rapprocher au mieux d’une exposition chronique. Or, les cultures primaires de trophoblastes tendent à dégénérer rapidement, environ 72h après isolement. Notre intérêt s’est alors porté sur un autre modèle placentaire, la lignée de cellules BeWo, que nous avons exposée aux micropolluants durant un temps d’incubation plus long que les cultures primaires de trophoblastes.
LIGNEE DE TROPHOBLASTES BeWo
Figure 23. Viabilité cellulaire. Les cellules sont incubées pendant 72 heures avec une gamme de concentration de BaP puis la viabilité cellulaire est évaluée par un test au rouge
neutre en microtitration cytofluorimétrique.
Après 72 heures d’incubation, le BaP ne semble induire aucune cytotoxicité significative. Cependant, la grande variabilité existant au sein de chaque condition rend difficile une analyse statistique correcte.
Afin de déterminer si cet effet de mauvaise reproductibilité est dû au micropolluant BaP ou au modèle cellulaire utilisé, nous avons incubé cette lignée avec un autre micropolluant d’intérêt, le DEHP.
Figure 24. Viabilité cellulaire. Les cellules sont incubées pendant 72 heures avec une gamme de concentrations de DEHP puis la viabilité cellulaire est évaluée par un test au
rouge neutre en microtitration cytofluorimétrique. *** p < 0.001 vs 0µM de DEHP.
Après 72 heures d’incubation, le DEHP induit une perte de viabilité significative à partir de 25µM. Cependant, là encore, la grande variabilité existant au sein de chaque condition rend difficile une analyse statistique correcte pour les concentrations inférieures à 25µM.
Afin de mieux comprendre cette forte variabilité, nous avons observé les tapis cellulaires au microscope à chaque étape de l’expérimentation.
Figure 25. Tapis cellulaire de cellules BeWo décollées observé en microscopie optique après le second rinçage au PBS du test au Rouge neutre (x100). Ce tapis cellulaire n’est
incubé avec aucun micropolluant.
Il apparait que le tapis cellulaire de BeWo à confluence, qu’il soit incubé ou non avec le micropolluant, se décolle lors des différentes étapes de rinçage et de dépôt de sonde du test au rouge neutre. En effet, le tapis cellulaire est encore à confluence lorsque le produit à tester est éliminé par retournement de la microplaque mais les cellules se décollent lors de l’ajout de la sonde rouge neutre et les rinçages au PBS (Figure 25). Cette observation expliquerait ainsi la faible reproductivité entre les différents puits d’une même condition et ainsi la grande variabilité des résultats obtenus.
Du fait de la forte variabilité des résultats observée, la lignée cellulaire BeWo qui est couramment utilisée pour les études de physiologie placentaire ne semble pas facilement utilisable en routine pour les tests de toxicologie qui se font principalement en microplaque. Nous avons donc comparé les tapis cellulaires de la lignée JEG-3 aux BeWo.
LIGNEE DE TROPHOBLASTES JEG-3
Figure 26. Tapis cellulaire de cellules JEG-3 observé en microscopie optique après le second rinçage au PBS du test au Rouge neutre (x100). Ce tapis cellulaire n’est incubé avec
aucun micropolluant.
Après observation microscopique, les cellules JEG-3 ne se décollent pas après rinçage au PBS lors de la réalisation des tests de viabilité, à l’inverse des cellules de la lignée BeWo.
• Discussion
Les cultures primaires sont difficiles à récupérer car leur obtention est dépendante des services hospitaliers. Elles permettent difficilement d’obtenir des résultats reproductibles du fait de la variabilité interindividuelle et ne peuvent être en contact avec les produits à tester que durant 48 heures maximum ; elles ne nous semblent donc pas un modèle facilement utilisable pour l’étude de la cytotoxicité de micropolluants chroniques. La lignée de trophoblastes BeWo est couramment utilisée dans les études de physiologie placentaire mais elle ne semble pas être adaptée aux tests en microplaque. Or, la majorité des études de toxicologie se faisant sur ce type de support, cette lignée ne semble pas adaptée à nos études. Etant donné que les cellules de la lignée JEG-3 ne se décollent pas en microplaque, nous avons réalisé la suite de nos travaux sur cette lignée de trophoblastes.
Recherche sur le micropolluant DEHP et son
métabolite le MEHP
3.2. ETUDE DES EFFETS DU DEHP ET DE SON METABOLITE LE MEHP