Chapitre 3 Etude in-vitro
II.1.1. Tests quantitatifs
Méthode
Le bleu de Trypan rentre dans les cellules et est relargué par les cellules vivantes mais reste dans les cellules mortes ; il permet donc de différencier les cellules mortes, en bleu, et les cellules vivantes, incolores. Le mécanisme d’exclusion nécessitant de l’énergie, seules les cellules pouvant synthétiser de l’ATP sont capables de faire sortir le bleu de Trypan. A J1, les cellules U87 sont ensemencées dans des plaques 12 ou 24 puits à une concentration de 2,4 ou 1,2.105 cellules/puits, respectivement. Les
particules sont ajoutées 24 h après (J2). Pour cela, les particules sont lavées deux fois à l’éthanol puis deux fois au milieu de culture pour une concentration finale de 1,2 g/l. Une dilution en cascade avec un facteur 5 est ensuite réalisée pour obtenir des concentrations de 0 à 1,2 g/l. 250 ou 500 µl de suspension de particules par puits sont ajoutés pour les plaques 24 et 12 puits, respectivement. 24 h plus tard (J3), les cellules sont trypsinées et récoltées dans des tubes. C’est pour cette étape de trypsination qu’il est plus facile d’utiliser des plaques 12 ou 24 puits plutôt que des plaques 96 puits utilisées classiquement. Du bleu de Trypan est ajouté à une dilution [1:1] et les cellules sont déposées sur une lame de Malassez. Les cellules vivantes et mortes sont alors comptées en fonction de leur coloration. L’expérience a été
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réalisée trois fois, avec deux comptages pour chaque échantillon, excepté pour la concentration la plus haute, qui n’a été réalisée qu’une fois.
Lors d’un test LDH, la perméabilité de la membrane cellulaire est évaluée par le dosage du lactate déshydrogénase (LDH), enzyme cytoplasmique stable présente dans toutes les cellules, qui est relarguée hors de la cellule lorsque celle-ci perd son intégrité membranaire. Le début du protocole est identique au test avec le bleu de Trypan, les cellules étant ensemencées dans une plaque 96 puits avec 5,0.104
cellules/puits. A J2 une dilution en cascade avec un facteur 2 est réalisée pour obtenir des concentrations en particules de 0,02 à 1,5 g/l dans du milieu de culture. Le surnageant est enlevé puis remplacé par le milieu de culture contenant les particules. A J3, 50 µl de surnageant de chaque puits sont prélevés en prenant soin de ne pas créer de mouvements qui décolleraient les particules en fond de plaque, et transférés dans un nouvelle plaque 96 puits. Le transfert du surnageant vers une nouvelle plaque permet de mesurer l’absorbance sans interaction des particules. 100 µl d’un mélange de réactifs sont ajoutés dans chaque puits. Après 5 min de réaction à température ambiante, 10 µl de HCl à 1 M sont ajoutés pour stopper la réaction. La lecture de l’absorbance se fait à 490 nm. L’intensité de l’absorbance est mesurée avec un lecteur de plaque (SpectraMax M2, Molecular Devices), et est proportionnelle à la concentration en LDH. Un contrôle avec des cellules seules (Isaines) et un contrôle avec des cellules
incubées avec 0,1 % de Triton (Imortes) permettent de définir le 100 et le 0 % de viabilité. Le Triton X-
100 est un détergent qui provoque la mort des cellules. La viabilité de chaque échantillon est alors calculée de la façon suivante :
%𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑡é = 100 × (𝐼é𝑐ℎ𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑙𝑜𝑛− 𝑚𝑜𝑦(𝐼𝑚𝑜𝑟𝑡𝑒𝑠)) (𝑚𝑜𝑦(𝐼𝑠𝑎𝑖𝑛𝑒𝑠) − 𝑚𝑜𝑦(𝐼𝑚𝑜𝑟𝑡𝑒𝑠)) L’expérience a été réalisée 4 fois sur 4 puits.
Le test WST-1 est basé sur le même principe que les tests CCK-8, MTT et MTS. Le sel de tétrazolium WST-1 est réduit par la NADH au cours de la chaîne respiratoire de la cellule et forme ainsi du formazan. La concentration en formazan permet d’évaluer l’activité métabolique des cellules. A J3, après le prélèvement des aliquots destinés au test LDH, le surnageant de chaque puits est aspiré et remplacé par 100 µl de milieu de culture sans sérum, supplémenté de 10 % de WST-1. Après 1 h d’incubation, la plaque est centrifugée 5 min à 500 rpm et 50 µl de chaque puits sont transférés dans une nouvelle plaque 96 puits, pour éviter toute interférence lors de la lecture de l’absorbance à 450 nm. L’absorbance est proportionnelle à la concentration en formazan. Un contrôle avec des cellules seules et un contrôle avec des cellules incubées avec 0,1 % de Triton X-100 permettent de définir le 100 et le 0 % de viabilité. La viabilité est calculée de la même façon que pour le test LDH. L’expérience a été réalisée 4 fois sur 4 puits.
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Résultats
Les résultats de viabilité cellulaire suite à l’exposition aux particules sont montrés en Figure 26. Pour pouvoir comparer les résultats obtenus avec les trois méthodes dans des supports différents, la concentration en particules est expimée en g/cm². Cette unité peut être utilisée étant donné que nos particules sédimentent rapidement et tapissent alors la surface du puits.
Figure 26 : Pourcentage de viabilité des cellules après 24 h d’incubation avec des concentrations différentes de particules, mesuré par un test au Bleu de Trypan, un test WST-1 ou un test LDH
Avec le marquage au bleu de Trypan, la diminution de la viabilité est au maximum de 5,6 % pour une concentration en particules inférieure à 6,3.10-4 g/cm². Pour une concentration de 6,3.10-3 g/cm², le taux
de viabilité est de 56,2 %.
Le test WST-1 montre une diminution de la viabilité d’au maximum 12 % pour une concentration de particules comprise entre 5,0.10-6 et 3,2.10-4 g/cm².
Avec le test LDH, la viabilité est comprise entre 96 et 102 % pour une concentration de particules comprise entre 7,5.10-6 et 4,8.10-4 g/cm².
Les résultats obtenus avec les différents tests montrent que les particules seules n’induisent pas d’augmentation de la perméabilité de la membrane cellulaire ni de diminution de l’activité mitochondriale des cellules et n’influent pas non plus sur la production d’ATP pour une concentration en particules inférieure à 3,2.10-4 g/cm². Il est possible qu’une très haute concentration de particules
influent sur la production d’ATP, comme le montre le test au bleu de Trypan pour une concentration de 6,3.10-3 g/cm². Cependant, pour les concentrations plus faibles, la production d’ATP des cellules n’est
pas perturbée par les particules. Les trois tests nous permettent donc de conclure à la non-toxicité des particules jusqu’à une concentration de 3,2.10-4 g/cm². Ce sont donc des concentrations inférieures à
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