Etude histologique

Une première évaluation de l’impact du traitement sur les tissus est réalisée par des marquages HE. Des exemples de coloration obtenus pour un groupe contrôle sans particules et des groupes traités sont montrés en Figure 54.

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Figure 54 : Marquages HE d’échantillons soumis au champ magnétique pour A/ le groupe contrôle U87 CM 48h et B/ les groupes avec injection de particules : B/i groupe U87 NP CM 6h, B/ii groupe U87 NP CM 24h, B/iii groupe U87 NP CM 72h, B/iv groupe U87 NP CM 7j. Sur toutes les images, la barre d’échelle correspond à 100 µm.

Les colorations obtenues sur les tissus traités sont assez similaires à celles des tumeurs injectées avec des particules, comme vu précédemment. Des cellules acidophiles sont encore présentes comme montré en Figure 54B/i et ii. Des zones nécrotiques au centre de la tumeur sont encore observables sur certaines coupes (Figure 54B/iii). De même, quelques cas d’œdèmes sont encore répertoriés. La réaction inflammatoire est encore principalement effectuée par des granulocytes (Figure 54B/i). De même que pour les tissus injectés avec des particules mais non soumis au champ magnétique, aucun macrophage n’a été observé autour de la trace d’injection.

Les colorations histologiques ne montrent pas de différence significative entre les tissus traités et ceux seulement injectés avec des particules.

L’analyse macroscopique des colorations effectuées 7 jours après l’application du champ magnétique nous renseignent sur la repousse de la tumeur après traitement (Figure 55).

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Figure 55 : Marquages HE de A/ groupe U87 NP 72h et B et C/ groupe U87 NP CM 7j. B/ii photographie de l’échantillon prise pendant la coupe. Les rayures visibles sur l’image A sont des artefacts dus à la préparation de l’échantillon. Sur toutes les images, la barre d’échelle correspond à 100 µm.

En effet, dans la plupart des cas, les particules restent le long de la trajectoire d’injection, comme montré par exemple en Figure 55A. 7 jours après le traitement, les particules ne sont plus le long d’une ligne droite mais sont dispersées de manière moins linéaire (Figure 55B/i). Cette dispersion peut s’expliquer par la trace d’injection qui a été déplacée, comme nous pouvons le voir lors de la coupe (Figure 55B/ii). Ce phénomène peut s’expliquer par une pousse des cellules tumorales de part et d’autre de la trace d’injection, qui aurait alors déplacé les particules de manière non uniforme.

Sur la Figure 55C, la densité de noyaux est plus importante autour des particules. Ici encore, ce phénomène peut s’expliquer par une croissance des cellules tumorales dans cette zone, 7 jours après l’application du champ magnétique.

La repousse des cellules observée 7 jours après l’application du champ magnétique devra être prise en compte pour définir les fréquences de répétition du traitement.

Les résultats obtenus lors de l’étude in-vitro ont fait apparaitre un possible effet du traitement sur la prolifération. Pour étudier ce mécanisme in-vivo, un marquage de l’antigène Ki-67 est réalisé (Figure 56). Le Ki-67 est une protéine présente dans le noyau des cellules prolifératives. En complément du marquage de la prolifération, un marquage de la GFAP est effectué. La GFAP est une protéine appartenant à la famille des filaments intermédiaires qui est surexprimée dans les gliomes et pendant la gliose (prolifération des cellules gliales) suite à un traumatisme (Ding, Haglid, and Hamberger 2000; Yang and Wang 2015). Elle est présente dans certaines cellules gliales et notamment les astrocytes, et participe au maintien de la forme cellulaire. Une contre-coloration est effectuée avec du Hoechst33342 pour colorer tous les noyaux. Les noyaux des cellules prolifératives sont ici marqués en vert, la GFAP est marquée en rouge et les noyaux de toutes les cellules sont marqués en bleu.

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Figure 56 : Marquage Ki-67 – GFAP – DAPI de coupes montrant la zone tumorale pour les groupes A/ U87 CM 48h ; B/i U87 NP 48h ; B/ii U87 NP 7j ; C/i U87 NP CM 6h ; C/ii U87 NP CM 24h ; C/iii U87 NP CM 72h ; C/iv U87 NP CM 7j. Les protéines Ki-67, présentes dans les noyaux des cellules proliférantes sont marquées en vert. Les protéines GFAP, filaments faisant partie du cytosquelette, sont marquées en rouges. Les noyaux sont marqués en bleu. Sur toutes les images, la barre d’échelle correspond à 200 µm.

Les marquages de la protéine Ki-67 ne montrent pas de différence significative entre les tumeurs contrôles, les tumeurs injectées avec des particules et les tumeurs soumises au traitement. Il semblerait que le Ki-67 soit surexprimé à 6 et 24 h après l’application du champ magnétique (Figure 56C/i et ii). Cependant, cette surexpression est observée à distance des particules et le Ki-67 n’est pas exprimé dans la zone nécrotique au centre de la tumeur. Il est peu probable que l’activation de la prolifération dans une zone aussi éloignée des particules soit causée par le traitement. A cause d’un problème de conservation des échantillons, ce marquage n’a pu être réalisé que sur un seul échantillon pour les groupes U87 NP CM 6h et U87 NP CM 24h, une éventuelle surexpression du Ki-67 à proximité des particules dans les 24 h suivant le traitement n’a donc pas pu être confirmée. La zone présentant une plus forte densité de cellules autour de l’injection des particules 7 jours après l’application du champ

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magnétique est aussi caractérisée par une surexpression du Ki-67, comme nous pouvons le voir en Figure 56C/iv en bas à droite de l’image.

La GFAP est principalement exprimée en bordure de la tumeur. L’aspect morphologique et l’expression est similaire pour le groupe contrôle, pour les groupes injectés avec des particules et pour les groupes traités. Une surexpression de la GFAP avait été reportée dans la zone lésionnelle de l’injection de l’aiguille, dans le cas d’aiguilles de 28 Gauge (360 µm de diamètre externe) (Cunningham et al. 2008). Nous n’observons pas ce phénomène sur nos coupes, probablement grâce à la petite taille de l’aiguille utilisée.

L’étude réalisée in-vitro nous a montré une forte diminution du nombre de cellules cancéreuses après traitement et un comportement cellulaire très affecté, avec notamment une inhibition de la prolifération (chapitre 3, IV). Notre étude histologique in-vivo ne montre pas de diminution de la taille de la tumeur ni de différence morphologique des cellules après traitement TEMMP. La prolifération cellulaire n’est pas non plus diminuée suite au traitement. La différence d’effets obtenus entre les résultats in-vitro et in-vivo peut s’expliquer par un problème de pertinence du modèle. En effet, la viscosité du milieu est très différente entre ces deux modèles, aboutissant à un stress mécanique subi par les cellules et des mécanismes impliqué très distincts. Les problématiques liées au modèle in-vitro seront discutées dans la partie suivante (chapitre 4, IV). Des marquages complémentaires pourraient être réalisés pour étudier d’autres mécanismes activés par le traitement. L’activation de l’apoptose déjà répertoriée dans certaines publications (Y. Cheng et al. 2015) ou le comportement des filaments d’actine pourraient par exemple être investigués.