Mise au point de la méthode

Pour notre modèle, les cellules sont ensemencées de sorte à former des sphères puis insérées dans un gel. L’injection des particules ainsi que l’application du champ magnétique peut alors se faire de manière similaire aux expérimentations in-vivo. Le protocole est résumé en Figure 64, et détaillé ci-après.

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Figure 64 : Schéma présentant le protocole de culture de cellules en 3D. A/ Les cellules sont ensemencées dans une plaque faible adhésion à fond rond. B/ Les cellules s’assemblent les unes aux autres pour former une sphère. C/ Les sphéroïdes sont insérés dans un gel d’agarose. D/ Les particules sont injectées. E/ Le champ est appliqué.

Création des sphéroïdes

Les cellules sont ensemencées dans une plaque 96 puits faible adhésion à fond rond à une concentration de 5.105 _{cellules/ml et 200 µl/puits (Figure 64A). Le milieu de culture est changé deux fois par semaine,}

en prenant soin de ne pas aspirer la sphère. Les puits en périphérie sont remplis d’eau ou de D-PBS afin de limiter l’évaporation du milieu de culture. Le fond de la plaque étant non-adhérent, les cellules vont progressivement s’assembler les unes aux autres (Figure 64B). La concentration des cellules est choisie pour maximiser la taille de la sphère tout en conservant la forme sphérique. En effet, si la concentration en cellules est trop importante, les cellules vont s’assembler en formant une coupole. Il est aussi possible de former des sphéroïdes en utilisant des plaques à fond rond adhérentes en recouvrant le fond d’une couche de gel d’agarose pour bloquer l’adhésion des cellules. Cependant, l’utilisation de plaques faible adhésion est préférable car elle permet d’obtenir plus rapidement des sphéroïdes présentant une meilleure homogénéité, des tailles plus importantes et une structure plus compacte (Vinci et al. 2012).

Préparation du gel d’agarose

Afin que les cellules situées en périphérie de la sphère soient elles-aussi dans un environnement de viscosité similaire à celui du cerveau, les sphéroïdes sont encapsulés dans un gel d’agarose (Figure 64C). Des études ont montré qu’un gel d’agarose à 0,6 % est de viscosité similaire à celle du cerveau (Pomfret,

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Miranpuri, and Sillay 2013). Cependant, les tumeurs cérébrales sont plus dures que le tissu sain. De plus, nos premiers essais réalisés à 0,6 % ont abouti à des gels trop fragiles. Pour ces raisons, nous réalisons pour la suite des gels à 1 %. Après une semaine de culture des sphéroïdes, de l’agarose est dissout au bain-marie ou au micro-onde dans du DMEM+GlutaMax (équivalent à du milieu de culture sans SVF, le SVF étant sensible à la chaleur) à une concentration de 2 % (w/v). Après refroidissement jusqu’à 37°C au bain-marie, un volume de milieu de culture identique à celui de la solution est ajouté afin d’obtenir un gel final à 1% (w/v). La solution de gel est maintenue au bain-marie à 37 °C puis est rapidement déposée dans un moule (profondeur ~7 mm, diamètre ~4 mm). Les sphères sont alors doucement prélevées à la micropipette avec un cône 1 ml puis déposées au centre du moule, en évitant le plus que possible l’ajout de milieu de culture au centre du gel. Après démoulage, les gels sont déposés dans une plaque 6 puits à raison de 3 à 7 gels par puits, et immergés de milieu de culture. L’intérêt d’utiliser un tel moule est d’obtenir des gels individuels, facilement manipulables et qui peuvent être transférés d’un support à un autre.

Injection des particules

Afin de se rapprocher au mieux des conditions de l’in-vivo, nous utilisons une seringue Hamilton avec une aiguille en fibre de verre identique à celle utilisées pour les injections in-vivo. Les particules sont mises en suspension dans du PEG200. Le gel est déposé sur un élévateur placé en dessous de l’aiguille

(Figure 64D). Le gel est alors élevé jusqu’à ce que l’aiguille pénètre le sphéroïde. Cette opération est assez délicate et nécessite de s’y reprendre à plusieurs fois. En effet, cette expérience est réalisée sous poste de sécurité microbiologique (PSM), contraignant la visibilité sur la sphère et l’aiguille. De plus les sphéroïdes sont un peu mobiles dans le gel. Si l’aiguille n’est pas située pile au centre de la sphère, celle-ci va glisser sur les côtés pour éviter l’aiguille. Cela nous renseigne sur une certaine élasticité des sphéroïdes. Le déplacement des sphéroïdes dans le gel peut s’expliquer par le fait qu’un faible volume de milieu de culture est inséré en même temps que le sphéroïde pendant la mise en gel et formerait ainsi une bulle de liquide autour du sphéroïde. Pour tenir compte de la plus petite taille du sphéroïde, un volume de 2 µl est injecté (contre 5 µl in-vivo) à l’aide d’un pousse-seringue à très faible débit (1 µl/min), cette vitesse d’injection ayant été optimisée lors des expérimentations in-vivo.

Pour comparaison avec une méthode simplifiée, les particules sont ajoutées en même temps que les cellules dans la plaque 96 puits à fond rond.

Application du champ magnétique

Les gels sont déposés au centre d’un Labtek 1 puits puis immergés de milieu de culture. Afin d’assurer une homogénéité du champ reçu par tous les sphéroïdes, nous disposons au maximum 9 gels au centre

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du Labtek. Celui-ci est ensuite placé au centre du cylindre de Halbach et le champ est appliqué pendant 45 min à une fréquence de 20 Hz (Figure 64E).

Analyse des échantillons

Un des avantages majeurs de cette méthode est qu’elle permet d’analyser les sphéroïdes avec les mêmes protocoles que les tissus in-vivo. Les gels sont congelés dans de l’isopentane à -60 °C. Ils sont ensuite coupés en tranches de 12 µm à l’aide d’un Cryostat maintenu à -20 °C, et récupérés sur des lames de verre appropriées.

Des marquages sont ensuite effectués afin de révéler certains éléments des cellules. Les marquages HE et Ki-67 sont réalisés selon le même protocole que pour les échantillons in-vivo (annexe V). Des analyses au TEM ont également été réalisées d’après le protocole présenté en annexe IV.