Chapitre 1 Introduction
1.8 Technologies de micro-puces et les pathologies rénale
De plus en plus, l’étude de maladies complexes telles que le diabète ou l’hypertension nécessite une compréhension plus complète des réseaux moléculaires et biochimiques qui participent aux différentes pathologies physiologiques. Or, pour être en mesure de mieux définir les relations entre ces réseaux, il est primordial de pouvoir compter sur un outil qui offre un aperçu immédiat des niveaux d’expression d’une multitude de transcrits biologiques. Une telle technologie est disponible, il s’agit des micro-puces à ADN. Cette technologie permet de passer de l’analyses des fonctions de gènes spécifiques à une étude exhaustive des milliers de transcrits. Ainsi, il est possible de mieux comprendre l’interaction entre des dizaines de voies biologiques présentes dans un modèle biologique et sur un tissu spécifique [402].
Décrite depuis 1995 [403] mais utilisée de façon plus générale depuis le début des années 2000, la technologie des micro-puces à ADN est en soi simple : il s’agit simplement de molécules d’ADN (sondes) alignées ou attachées sur une surface solide, la plupart du temps une puce de composés polymères [404]. Cette plate-forme permet ainsi, par la liaison entre les nucléotides d’un échantillon type et l’ADN des sondes sur la puce, de déterminer le niveau d’expression de milliers de gènes cibles par le transfert d’un signal correspondant à la quantité de nucléotides marqué lié sur la puce.
Figure 1-29. Schéma d'une expérience de micro-puces. Affymetrix.com
La réalisation d’une expérience de micro-puces se fait en plusieurs étapes qui peuvent varier selon le type d’expérience et de micro-puces. Dans les cas de puces d’expression de transcrits génétiques de type simple Affymetrix (ARNm), voici cette séquence :
i. Purification : Les échantillons sont purifiés, et l’ARNm des cellules est isolé.
ii. Transcription inverse : L’ARNm est transformé en ADNc par enzyme de transcriptase inverse
iii. Un second brin d’ADNc complémentaire est synthétisé à partir du produit de transcription inverse, transformant le produit ADNc en ADN double-brin.
iv. Une transcription In Vitro est ensuite réalisé avec de l’ARN marqué avec de la biotine (marqueur fluorescent) afin d’amplifier cet ARNa (ARN amplifié)
v. Suivant une purification de cet ARNa, celui-ci est hybridé sur la puce en vue d’analyse du signal de fluorescence.
Les technologies de puces ont cependant des faiblesses, l’une d’entre elle étant basée sur la dépendance de cette technologie à une excellent compréhension de la majorité des gènes et transcrits présent dans un organisme. Ainsi, la limite des technologies des micro-puces est dépendante de la quantité et de la validité des annotations reliées aux amorces hybridées sur les puces [405, 406]. De plus, il faut s’assurer, par des études de la qualité de l’ARNm, qu’il n’y a pas de présence d’autres nucléotides tels que l’ADN dans les échantillons utilisés pour les expériences de micro-puces.
1.8.2 Historiques des études de micro-puces dans les maladies rénales
Dans le cadre de cette thèse, différentes analyses de micro-puces ont été effectuées sur les modèles développés dans notre laboratoire. Or, depuis la mise au point de cette méthode d’analyse génomique, différents groupes ont utilisés cette technologie pour établir un profil d’expression génétique et tenter de découvrir de nouveaux gènes impliqués dans l’évolution de maladie rénales.Une des premières analyses impliquant les reins de souris diabétiques a été effectuée par Wada et al. en 2001 [407] sur un modèle de souris diabétiques induites par injections de STZ. Pour ce faire, ceux-ci ont isolé l’ARNm de reins totaux de souris ayant subi ou nom une néphrectomie avant d’utiliser la technologie de micro-puces à ADN afin de déterminer les voies métaboliques impliqués dans la progression de la néphropathie diabétique. Par ces analyses, de nombreux gènes potentiellement impliqués dans ce modèle ont été déterminés, tels que des gènes reliés à la gluconéogenèse, ainsi que des gènes reliés au métabolisme des lipides. De plus, différents gènes reliés au MAP kinases et à la génération de protéine de la matrice extracellulaire ont été observés comme étant surexprimés dans les reins de souris injectées avec STZ. Ainsi, cette étude fût une des premières investigations permettant de mieux comprendre les changements rénaux reliés à la progression de la néphropathie diabétique, tout en affirmant la possibilité de
l’utilisation des méthodes de biotechnologiques à haut débit pour la compréhension des pathologies rénales.
En 2004, une autre série d’analyses par micro-puces sur différents modèles de néphropathie diabétique a été effectuée par Susztak et al. [408], qui ont isolé l’ARNm de reins totaux
provenant de deux modèles distincts, soit les souris db/db ou les souris induites au diabète par injections de STZ et comparées avec des contrôles. De façon intéressante, ceux-ci ont découvert que l’ostéopontine faisait partie des meilleurs marqueurs de l’expansion de la matrice
mésangiale rénale. Il a ainsi été possible, lors d’expériences complémentaires sur des animaux diabétiques db/db, de relier l’expression de ce gène avec la le niveau de glomérulopathie rénale. Cette analyse concorde ainsi avec les résultats obtenus dans notre laboratoire, qui ont
déterminé que l’ostéopontine était surexprimé de façon importante dans les tubules proximaux de rats diabétiques et les lignées cellulaires de tubules proximaux [409].
Une autre publication d’intérêt clinique impliquant les micro-puces a été publiée en 2004 par Vaelde et al. , qui ont cherché à déterminer les voies génétiques régulées dans les glomérules de patients atteints de néphropathie diabétique et comparé avec les glomérules de patients en santé. À partir de reins de patients qui étaient non conforme pour des transplantations, ils ont isolé l’ARNm de glomérules, qu’ils ont ensuite utilisé pour des expériences de micro-puces suivies d’analyses par PCR en temps réel. Ils ont ainsi été en mesure de remarquer que plusieurs gènes reliés au transport de molécules ainsi qu’à la réparation cellulaire. Aussi, ils ont confirmé un rôle entre leur résultats et les dommages vasculaires, l’expansion de la matrice mésangiale, la prolifération cellulaire et la protéinurie.
En 2006, Makino et al. ont publié une étude sur les glomérules de souris diabétiques db/db et la régulation des voies génétiques qui pourraient être reliées à la néphropathie diabétique. Pour ce faire, ceux-ci ont isolé l’ARNm de glomérules de souris contrôles et db/db à un stade précoce de la néphropathie diabétique, et ce avant que n’apparaissent des changements histologiques afin que les gènes différemment exprimés ne soient pas reliés aux altérations cellulaires suivant les dommages rénaux, mais bien aux dommages rénaux glomérulaires. De plus, ils ont administré de la pioglitazone (agoniste de PPARγ) sur des souris db/db afin de comprendre comment cette molécule agi sur la régulation génétique et mène à une sensibilisation à l’insuline. De plus, un
autre groupe a récemment publié sur les effets de la surexpression de KAP dans les tubules proximaux [410].