Perspectives

4.6.1 Méthodologie de découverte de biomarqueurs

La méthodologie employée au cours de cette thèse consiste en une utilisation séquentielle de technologies de pointes ayant comme objectif un criblage rapide et efficace de différentes cibles d’intérêt clinique. Il est possible de résumer cette méthodologie comme une liste d’étapes à suivre qui pourra être appliquée à d’autres modèles d’étude :

i. Identification et caractérisation des pathologies reliées à des modèles in vivo. Pour ce faire, différents modèles d’animaux transgéniques ou non peuvent être utilisés, tout comme la collecte d’échantillons cliniques.

ii. Isolation de cellules ou tissus spécifiques (tubules proximaux rénaux dans le cadre de cette thèse) et purification des échantillons d’expression (ARNm, protéines) et d’histologie.

iii. Utilisation de micro-puces à ADN afin de rapidement observer la presque totalité des voies métaboliques de régulation génétiques du modèle étudié. Identification des gènes différemment exprimés.

iv. Recherche de littérature et utilisation de bases de données d’annotations génétiques afin de développer différentes hypothèses impliquant les voies métaboliques soupçonnées de jouer un rôle dans les différentes pathologies observées in vivo.

v. Confirmation de l’expression génétique des marqueurs d’intérêt par techniques de PCR en temps réel et Western Blot. Analyse d’immuno-histochimie afin de confirmer la

localisation de l’expression.

vi. Utilisation de modèles ex vivo et in vitro représentatifs pour mieux étudier un modèle isolé relié aux marqueurs cibles. Caractérisation des propriétés de ces modèles (par exemple, effets pro-apoptotiques ou réaction à la concentration de glucose).

vii. Caractérisation précliniques et cliniques des niveaux d’expression de ces marqueurs dans un nombre plus élevé d’échantillon. Détermination de niveaux d’expression de marqueurs associés dans les échantillons biologiques tels que l’urine ou le plasma.

Ainsi, cette approche permet de rapidement tester de multiples biomarqueurs reliés de façon spécifique à un type cellulaire précis, ce qui diminue les chances d’échantillons négatifs reliés à une différence dans les types cellulaires isolés ou à l’impureté des échantillons. Dans les

pathologies rénales, de telles approches utilisant les micro-puces sont déjà en cours d’utilisation pour les carcinomes rénaux [515] ainsi que pour les transplantations rénales [516-518].

4.6.2 Techniques de microdissection par capture au laser

Figure 4-2. Procédure de préparation pour la microdissection et capture au laser. (Arcturus inc.)

Une des techniques envisagées pour l’amélioration du processus de découverte de

biomarqueurs est l’utilisation de la technologie de microdissection par capture au laser (LCM), qui sont présentement employée dans les pathologies reliées au cancer [519] et à la

glomérulosclérose [520]. En effet, même si les protocoles d’isolation cellulaire de tubules proximaux sont efficaces et génèrent normalement des échantillons très purs, cela nécessite le développement d’un protocole d’isolation très précis qui requiert de longues mises au points, en plus des heures de manipulations nécessaires à l’isolation de ces échantillons, ce qui entraine une dégradation possible des échantillons. De plus, l’isolation par gradient des tubules nécessite la perte ou une isolation non-spécifique des autres types cellulaires, ce qui nécessite de

posséder une certaine quantité de matériel biologique au départ pour être en mesure de récolter suffisamment d’échantillons. Or, ces conditions sont rarement retrouvées lorsque l’on travaille avec des échantillons cliniques provenant de biopsies.

Mais, en combinant l’utilisation de techniques de cryogénie des échantillons avec une technique de microdissection par capture au laser, il est possible de rapidement et efficacement isoler les cellules ciblées, permettant une isolation très spécifique de leur ARN, ADN ou protéines. Ainsi, cette combinaison de techniques permettrait le transfert et l’application de notre méthodologie de découvertes de biomarqueurs sur des échantillons cliniques.

4.6.3 Conclusions

Initiée par différentes observations impliquant le rôle des tubules proximaux dans le

développement précoce de pathologies rénales (en particulier de la néphropathie diabétique), cette thèse est parvenue à approfondir les connaissances dans ce domaine de différentes manières.

En premier lieu, l’utilisation de la technologie des micro-puces a rendu possible l’identification à haut débit de plusieurs nouveaux facteurs reliés à des conditions diabétiques, notamment les gènes Bmf et Caspase-12. Ceux-ci ont fait l’objet d’expériences plus approfondies confirmant leur implication dans les pathologies affectant les tubules proximaux (section 2 et [521]). Cette utilisation de la technologie des micro-puces pourra donc être envisagée pour l’identification d’autres marqueurs d’intérêt reliés à la progression de la néphropathie diabétique.

De plus, les résultats des expériences effectuées dans cette thèse ont permis d’identifier une meilleure synthèse des voies métaboliques reliées à l’augmentation du système RAS et des ROS dans les tubules proximaux (Figure 4-3), tel qu’illustré par les expériences entreprises sur les modèles transgéniques [495].

Figure 4-3. Les effets présumés de réno-protection de la catalase sur le développement des maladies rénales chroniques [522].

L’augmentation de ROS (bloqués par la catalase) induite par les NADPH oxydases va provoquer une activation de différentes voies métaboliques, notamment celles reliées à l’inflammation (TGF-β, PAI-I, MCP-I), à la fibrose (Col IV) et à l’apoptose (Bax, Caspase-3).

Or, une publication par Thallas-Bonke et al. [523] sur des cellules rénales a démontré une relation entre Ang II et l’activation des PKC à travers la génération des ROS (en particulier de PKC-α). Ainsi, tel que démontré par les expériences de Lee et al. [96] et différents autres groupes [494, 524] (Figure 4-4), il est probable que l’activation des PKC induise l’activation des NADPH oxydases suivant la phosphorylation de PKC sur les membranes rénales.

Figure 4-4. L’activation des PKC peut être le résultat d’une hausse des agents oxydatifs, qui peuvent être initiés par différents facteurs tels que l’hyperglycémie [525].

Mis en synthèse, ces résultats permettent donc de comprendre de façon générale la nature du développement de pathologies reliées à une amplification des voies métaboliques reliées à la l’activation du système RAS et à surexpression de ROS dans les tubules proximaux.