Techniques de préparation et de purification des acides nucléiques

L’étude génétique effectuée aux patients se fait sur les échantillons d’acide nucléique (ADN). Les leucocytes sanguins représentent la source majeure d’ADN, les autres sources cellulaires peuvent être des biopsies ou autre. Dans la grande majorité des cas, la technique d’extraction des acides nucléiques doit être adaptée à l’échantillon, à la nature du génome, au nombre de copies et à la méthode de biologie moléculaire utilisée (PCR).

Il existe plusieurs techniques utilisées pour l’extraction d’ADN génomique à partir du sang, celle employée dans notre étude est la technique au NaCl. Méthode décrite par Kunkel et al.

L’extraction de l’ADN est élaborée par deux manières distinctes: Extraction aux sels

Extraction par kit II.3.1. Extraction aux sels a. Principe

La technique d’extraction aux sels présente l’avantage, d’être simple, rapide et d’éviter les phases phénoliques toxique puisque les produits utilisés sont moins dangereux et moins onéreux. Le rôle du sel est de casser l’interaction entre la molécule d’ADN et l’eau, en neutralisant ces charges de phosphate de sucre, ce qui rend l’ADN moins hydrophile et donc beaucoup moins soluble, permettant à l’ADN de sortir de la solution et d’être isolé facilement.

b. Réactifs nécessaires (Voir Annexe) Tris-EDTA 20 mM / 5 mM Tris-EDTA 10 mM /1 mM SLB à +42°C Protéase K 10 mg/ml Na Cl 5 M Ethanol 75% à +4°C Eau Distillé stérile

c. Protocole expérimental

L’ADN génomique est extrait à partir du sang conservé dans le tube EDTA servant à le maintenir décoagulé, et puisque ce dernier est stocké à 20°C, une décongélation est impérative avant son utilisation.

 Lyse des globules rouges

Le sang est décongelé à +4°C ou à température ambiante et la lyse cellulaire est effectuée immédiatement après la décongélation. Le sang total est soumis à une lyse complète des globules rouges par incubation pendant 20 minutes dans de la glace après addition de deux volumes de tampon de lyse des hématies, tampon TE 20/5 (Tris-HCl 20 mM à pH 7.6 et 5 mM d’EDTA à pH 8). Après centrifugation à 3000 tours/minute pendant 5 minutes, le surnageant est éliminé pour se débarrasser des globules rouges. Le culot est remis en suspension dans le même tampon et recentrifugé dans les mêmes conditions. Le culot ainsi obtenu, est essentiellement constitué de leucocytes. Il peut être soit stocké à -20°C, soit utilisé directement pour l’extraction de l’ADN.

 Lyse des globules blancs

Après avoir débarrassé le culot des globules rouges, les globules blancs subissent une lyse via l’ajout de 3 ml de la solution SLB (Tris-HCl 10 mM à pH 7,6 , EDTA 10 mM, NaCl 50 mM, le détérgent SDS 0,2%). que chacun de ses composants entreprend une action précise, autrement exprimé, le tris Hcl est chargé de minimiser l’action des DNases alors que l’EDTA vise intégralement à les inactiver en chélatant leurs cofacteurs Mg²⁺, puis grâce au détergent SDS (Solution Dodécyl Sulfate) la destruction des protéines membranaires est initiée ainsi, via l’addition de 100 µl de protéinase K, l’élimination des éléments protéiques restantes est rendue possible et elle est favorisée par une incubation sous agitation douce pendant une nuit à 42°C.

 Dénaturation et précipitation des protéines et impuretés

Après protéolyse, les tubes sont additionnés de l’eau distillée stérile et d’une solution de NaCl à 5 M puis mélangées et centrifugées à 3000 tr/mn pendant 30 mn de manière à neutraliser les molécules d’ADN à fin de les rendre moins hydrophiles dans l’eau premièrement et par conséquent permettre la précipitation des protéines et des impuretés deuxièmement dans le culot.

 Précipitation et lavage de l'ADN

La précipitation de l’ADN s’effectue à de hautes concentrations de l’alcool éthylique (éthanol absolu stocké à -20 °C de forte force ionique -NaCl 5 M-), accélérée par le froid dont le but est de récupérer les acides nucléiques sous une forme solide. Ce qui permet d’une part de les protéger, et d’autre part, après séchage, de les resolubiliser à la concentration souhaitée. Cette étape consiste en un lavage par l’éthanol absolu froid à 2 volumes et 0,3 M de NaCl, puis alterné par un lavage à l’éthanol à 70% si nécessaire, et mélanger doucement pour éliminer les sels et précipiter l’ADN. A ce stade, l’ADN est bien visible sous forme de filament, pelote ou méduse.

 Récupération de l’ADN

L’ADN est recueilli dans un tube eppendorf de 1,5 mL, puis séché au centrifugeur (speedvac) pendant 20 minutes. Il est par la suite dissout et conservé dans du tampon TE 10/1 (TrisHCl 10 mM à pH 7,6 et d’EDTA 1 mM à pH 8), dont le volume est ajouté en fonction de la taille de la méduse de l’ADN et maintenu en agitation douce jusqu’à une dissolution complète de l’ADN, puis conserver à +4 °C si les échantillons sont utilisés dans les jours qui suivent, ou à -20 °C pour une utilisation ultérieure. Généralement on ajoute 300 µL à 500 µL de TE 10/1. II.3.2. Extraction au kit

Quel que soit le type de matrice, le principe des techniques d'extraction d'ADN est sensiblement le même et comprend quatre grandes étapes: la lyse des cellules, la dégradation des protéines libérées, la séparation des acides nucléiques des autres composants et la purification de l'ADN.

a. Extraction de l’ADN par Kit QIAGEN (Kit QIAmp DSP DNA Blood Mini)

Cette technique rapide, plus fiable et simple, à interaction minime avec l’utilisateur, ce qui permet de manipuler les échantillons potentiellement infectieux en toute sécurité. Après recueil du sang total sur EDTA, l'extraction de l'ADN génomique est réalisée sur mini colonnes

(Qiagen®: kit QIAamp DNA Blood Mini kit) (www.qiagen.com/resources/download.aspx?id=d11105d4-3499). Le kit Qiagen est un système ayant recours à la technologie des membranes de silice (QIAamp) pour l’isolation et la purification de l’ADN génomique à partir d’échantillons biologiques. Développé pour le traitement simultané de plusieurs échantillons de sang, il permet d’obtenir de l’ADN purifié prêt à l’emploi. Les procédures sont compatibles avec des échantillons de sang total et de sang frais ou congelé traités à l’EDTA ou au citrate. Cette technique s'effectue en deux étapes

permettant d’isoler et de purifier rapidement et en toute simplicité l’ADN génomique à partir de 200 µL de sang total (Il n’est pas nécessaire de séparer les leucocytes au préalable).

 1ère Etape de lyse:

Les échantillons sont lysés dans des conditions dénaturantes, à température élevée. Le sang est décongelé à +4 °C ou à température ambiante et la lyse cellulaire est effectuée immédiatement après la décongélation.

Dans un tube eppendorf de 1,5 mL, 200 µL du sang total est soumis à une lyse complète des globules rouges par incubation à 56 °C pendant 10 minutes après addition de 200 µL de tampon de lyse AL et 20 µL de protéinase K (Protéase QIAGEN - QP).

 2ème Etape de purification:

On ajoute 200 µL d’éthanol absolu et on centrifuge brièvement. Par la suite on prépare pour chaque échantillon une colonne QIAamp posée sur un tube collecteur, cette étape permet de fixer l’ADN génomique à la membrane de la colonne de centrifugation QIAamp Mini, on y dépose 620 µL de la solution obtenue, on centrifuge à 1771 G pendant 1 min puis on place la colonne sur un nouveau tube collecteur et on jette l’ancien tube et l’éluât.

L’ADN génomique est adsorbé sur la membrane de silice alors que le lysat passe à travers la membrane sous l’effet d’une dépression ou de la force centrifuge. Par la suite, on procède à un lavage de la membrane par les tampons du kit AW1 et AW2.

On dépose 500 µL de tampon AW1 fournis par le kit, on recentrifuge à 1771 G pendant 1 min et on replace la colonne sur un nouveau tube collecteur. On dépose 500 µL du tampon AW2 puis on centrifuge à 2877 G pendant 3 min. À cette étape, l’ADN est lavé.

On place ensuite la colonne QIAmp sur un tube eppendorf de 1,5 mL, on dépose 50 µL de buffer AE et on centrifuge à 1771 G pendant 1 min. A cette étape, l’ADN est élué. On Jette la colonne QIAmp et finalement on conserve le tube eppendorf contenant l’ADN extrait (volume final de 200 μL) à +4 °C si l’échantillon est utilisé dans les jours qui suivent l’extraction ou à -20 °C pour une utilisation ultérieure.

Les procédures d’extraction par les kits commercialisées, sont conçues pour limiter la contamination croisée d’un échantillon à l’autre. Les extraits d’ADN purifié sont prêts à l’emploi pour l’amplification en chaîne par polymérase (PCR) ou d’autres applications, et peuvent être conservés à +4 °C si les échantillons sont utilisés dans les jours qui suivent, ou à - 20 °C pour une utilisation ultérieure.

Le Kit ISOLAT II est spécialement conçu pour l'isolement rapide et efficace de l'ADN génomique extrêmement pur, à partir du sang total même de sang traité avec de l'EDTA, du citrate ou de l'héparine. L'ADN isolé est d'une grande pureté (rapport A260 / A280: 1,6-1,9) avec des rendements de 50-200ng /µl.

Avant de commencer l’extraction d’ADN:

• On s’assure que G3 Lysis Buffer, le tampon de lavage GW2 et la Proteinase K sont préparés. • On met l’incubateur ou le bain d'eau à 70 ° C.

• On Préchauffe Elution Buffer G à 70 °

Le protocole est le même que celui du kit d’extraction d’ADN du sang par QIAmp DNA Blood Mini kit Qiagen (Figure 18).

Figure 18: Isolement de l'ADN du sang par Bioline ISOLATE II Blood DNA Kit.

c. Extraction d’ADN par Wizard Genomic DNA Purification Kit/Promega

Cette technique d’extraction d’ADN est une manipulation particulièrement délicate qui s’effectue en trois étapes distinctes.

On met une quantité de sang de 300 µL dans un tube eppendorf de 1,5 mL, en ajoutant 900 µL de solution de lyse cellulaires, on laisse incuber pendant 10 min à température ambiante puis on centrifuge à 3320 G pendant 2 min et on enlève le surnageant.

 Lyse des globules blancs et précipitation des protéines:

On ajoute 300 µL de solution de lyse des noyaux et on mélange, si le culot n’est pas dissout on laisse incuber sur la nuit à 37 °C avant d’ajouter 100 µL de solution de précipitation de protéine et on centrifuge à 3320 G pendant 3 min.

 Précipitation d’ADN et réhydratation:

On transfère le surnageant dans un nouveau tube, on y ajoute 300 µL d’isopropanol et on centrifuge à 3320 G pendant 3 min. On enlève le surnageant, on ajoute 300 µL d’éthanol 70%, on centrifuge 3320 G pendant 3 min, puis on aspire l’éthanol et on laisse le culot. Par la suite, on ajoute 100 µL de solution de réhydratation de l’ADN, on laisse incuber 1 heure à 65 °C ou sur la nuit à +4 °C.