Réaction de séquence

a. Réaction de séquence par BigDye® Terminator v 3. 1 Cycle Sequencing

Selon la réaction de Sanger qui repose sur l’incorporation aléatoire de didéoxynucléotides interrupteurs de chaîne (ddNTP) eux aussi présents dans le milieu réactionnel dont chacun est marqué par un fluorophore dont le spectre d’émission est spécifique. Une analyse spectrale va différencier les différents fluorochromes, associer la base correspondante et donc définir la séquence nucléotidique du brin d’ADN initial. Les fragments d'ADN synthétisés portent ce fluorophore terminal. On les appelle des terminateurs d'élongation ou "BigDye Terminators" ou "Dye-labeledterminator".

Nous utilisons la technologie BigDye Terminator_version 2 (Applied Biosystems: ABI). La technologie BigDye Terminator (BDT) utilise un système de transfert d’énergie par

résonance (FRET) entre deux fluorochromes fixés sur le même ddNTP et reliés entre eux par un linker. Le premier est une fluorescéine (6 carboxyfluoréscéine) appelé fluorochrome donneur, commun aux quatre ddNTP. Le second est une dichlororhodamine (dRhodamine) qui joue le rôle de fluorochrome accepteur.

Le fluorochrome donneur est excité par un rayon laser à argon émettant à 488 nm et 514,5 nm. Son énergie de fluorescence émise (515-520 nm) est captée intégralement par le fluorochrome accepteur qui est excité à son tour. Le fluorochrome accepteur ou dichloroRhodamine est différent pour chaque type de ddNTP.

Le spectre de la fluorescence réémise sera ainsi spécifique de chaque type de ddNTP. Le transfert du signal de la fluorescéine vers la dRhodamine permet une amplification du signal et par conséquent, une augmentation de la sensibilité de la technique (Figure 27).

Figure 27: Mécanisme de la fluorescence par la technique du transfert d’énergie par

résonance.

La réaction de séquence est réalisée dans un volume final de 12,5 µL contenant: • 2µL du produit PCR purifié,

• 0,5µL d’une des 2 amorces (primer sens ou antisens) • 1µL du kit de séquençage (BigDye Terminator V3, 1) • 9µL H2O.

La solution du kit comprend les dNTP, les ddNTP marqués, l’Ampli Taq DNA polymérase et le tampon (Tris-Hcl PH 9 à 400 mM et MgCl2 à 10 mM). La réaction de séquence s’effectue dans un thermocycleur, selon le programme suivant:

o 96°C pendant 10 secondes

o 50°C pendant 05 secondes, 25 cycles o 60°C pendant 4 minutes

o 72°C pendant 7 minutes

Le produit de séquence peut être analysé tout de suite ou conservé à +4°C ou à -20°C dans l’obscurité.

b. Purification du produit de la réaction de séquence

Le Produit de la réaction de séquence doit être purifié afin d’éliminer les amorces libres, les dNTP, les ddNTP non incorporés, les sels ainsi que toutes les impuretés, qui peuvent altérer la lecture de la séquence. Cette purification est réalisée par Sephadex G50, soit avec de l’éthanol et de l’EDTA, ou encore par des billes magnétiques (MagneSil® Green Promega).

b.1.Purification par le Séphadex G50

La chromatographie d’exclusion va permettre le piégeage de particules de bas poids moléculaire sur une colonne Sephadex G50 constituée de billes perforées dont les trous ont un diamètre déterminé (ici de 20 à 50µm). Les petites particules de diamètre inférieur à ceux-ci entrent et sont piégées. A l’inverse les grosses vont passer autour et être éluées très rapidement. La réaction de séquence est purifiée par chromatographie pour piéger les ddNTP libres, en excès. En effet ces ddNTP libres non incorporés lors de la réaction pourraient parasiter les signaux de fluorescence spécifiques. Les sels éventuellement présents sont piégés de la même manière que les ddNTP.

Cette étape a pour but de purifier par gel-filtration des produits de réaction de séquence. Le Sephadex G50 utilisé permet de dé-saler les échantillons et d’éliminer les nucléotides non incorporés et les amorces en excès. La plaque 96 puits Multiscreen est utilisée comme support inerte de la résine G50. Charger le Sephadex G50 Superfine dans les puits d’une plaque MultiScreen en utilisant le chargeur de colonne de 45 µL comme suit:

Déposer le Sephadex G50 dans chaque puits du chargeur de colonne. Retirer l’excès de poudre avec la raclette.

Placer la plaque MultiScreen à l’envers sur le chargeur jusqu’au butoir et retourner l’ensemble.

Taper sur le chargeur pour évacuer le Sephadex G50 vers la plaque.

Ajouter 300 µL d’eau ultra pure dans chaque puits contenant du Sephadex G50. Fermer la plaque avec son couvercle

Laisser reposer 2 heures à température ambiante (une fois les mini-colonnes gonflées, la plaque peut être stockée à +4 °C)

Centrifuger 5 minutes à 553 G la plaque MultiScreen assemblée à une plaque récupératrice d’eau.

Diluer les produits de réaction de séquence avec 10 µL d’eau ultrapure. Déposer délicatement les échantillons à purifier au centre des mini-colonnes. Placer la plaque MultiScreen sur une microplaque Thermo Fast 96 puits. Centrifuger 5 minutes à 553 G.

b.2. Purification par les billes magnétiques

Cette méthode a été utilisée lorsque le nombre d'échantillons est <10 en cours de traitement. L’élimination des colorants terminateurs (Dye terminators) non incorporés se fait en utilisant MagneSil® Green selon les instructions du fabricant.

Dans un tube de PCR de 500 µL on réalise un mélange constitué de 10 µL du produit de réaction de séquence, 90 µL du «MagneSil® Green» (Proméga) et on incube à température ambiante en mélangeant par pipetage à des intervalles de 2,5 minutes et de 5 minutes. On place les tubes dans le portoir magnétique et on élimine le surnageant sans toucher les billes. On replace les tubes dans un portoir normal et on ajoute 100 µL d‟éthanol à 90%. On recommence ces étapes une seconde fois. On laisse sécher à température ambiante pendant 10 minutes, on ajoute 20 µL de formamide (Hi-Di™ Formamide, Applied Biosystems®), on incube à température ambiante pendant 2 minutes et on replace les tubes dans le portoir magnétique. On récupère le produit obtenu dans un nouveau tube afin de le séquencer ultérieurement.

b.3. Purification à l’éthanol et à l’EDTA

Une précipitation de l’ADN marquée avec de l’éthanol et de l’EDTA permet la purification des produits de réaction de séquence en capturant les dyes non incorporés dans la réaction, les sels et autresmolécules chargées qui pourraient interférer lors de la détection des bases par électrophorèse capillaire. Pour cela, on ajoute au produit de réaction de séquence, 5 μL d’EDTA à 125 mM, et 60 μL d’éthanol 100 %.

-On vortexe brièvement et on laisse les tubes à température ambiante pendant 15 minutes afin de précipiter les produits d’extension.

-On transvase le contenu dans des tubes de 1.5 mL,

-On centrifuge pendant 20 minutes à la vitesse de 3000 g pendant 30 minutes, puis on aspire soigneusement le surnageant.

-On ajoute 250 μL de l’éthanol 70 %,

-On vortexe brièvement et on centrifuge pendant 10 minutes à la vitesse de 1700 g pendant 15 minutes.

-On aspire soigneusement le surnageant,

-On laisse sécher les tubes dans un speed vac pendant 10 à 15 minutes, puis on resuspend le culot dans 20 µL de formamide désionisé et on installe les tubes dans l’appareil de séquençage.

II.7.4. Utilisation du séquenceur ABI 3130 XL pour la lecture de séquence: Eléctrophorégramme

Après avoir placé la microplaque Thermo Fast 96 puits dans le séquenceur (ABI Prism 3130, Applied Biosystems), on saisit à l’aide du logiciel 3130 Data Collection le nom et le prénom du Donneur, la température de migration (50°C) et le temps d’injection. Les données sont ensuite analysées par le logiciel Sequencing Analysis 3.7. Les résultats sont présentés par la machine sous forme de courbes (éléctrophotogramme) présentant la fluorescence détectée, et l’interprétation qui est faite en termes de nucléotides.