Techniques de mesure des automates :

Les techniques utilisables pour détecter la formation du caillot sont :

 Les techniques coagulantes ou chronométriques mesurant un temps de formation de caillot,

 Les techniques enzymatiques ou chromogéniques utilisant un enzyme et un substrat avec libération d’un chromogène,

 Les techniques immunologiques utilisant une réaction antigène-anticorps, a) La technique chronométrique :

La technique chronométrique consiste à mesurer la vitesse de formation du caillot de fibrine après ajout de réactif(s) déclenchant(s) approprié(s) [45]. Pour cette technique, on a deux différents systèmes de détection de caillot, qui sont utilisés :

 Système de détection photo-optique,  Système de détection électromécanique. Détection photo-optique :

Les systèmes optiques sont basés sur le fait que la formation de caillot provoque un changement dans la densité optique du plasma. Lors de la formation du caillot, les caractéristiques optiques du plasma/des réactifs mesurées initialement se modifient. Ces modifications sont monitorées et utilisées pour déterminer le temps nécessaire pour qu’un certain degré de changement se produise. [34]

Cette méthode de détection utilise deux propriétés photo-optiques [36] :

 La turbidimétrie : mesure l’épaisseur d’un milieu trouble empêchant la vision nette d’un test optique placé derrière ce milieu. Il s’agit de l’absorbance.

 La néphélémétrie : mesure l’intensité de la lumière diffusée par la suspension. Il s’agit de la diffusion.

Figure 15 : Diffusion et transmission de la lumière dans une suspension : I0 : intensité incidente, I :

intensité. [61]

• Coagulomètres à détection turbidimétrique, détectent lors de la formation de caillot un changement de densité optique (DO, transmittance) de plasma.

La lumière polychromatique est focalisée par un collimateur et filtrée pour transmettre une lumière d'une longueur d'onde spécifiée. La lumière monochromatique est transmise par la fibre optique et traverse la cuvette contenant l’échantillon. Quand la fibrine se forme, l’opacité augmente et l'intensité de la lumière atteignant le détecteur diminue (figure 16). Lorsque la densité optique atteint un certain niveau prédéterminé, le chronomètre s’arrête, indiquant la formation d'un caillot.

Les effets d’hyperlipidémie et l'ictère sont minimisés, parce que la Densité Optique (DO) de base est soustraite de la DO finale. [43]

Figure 16 : Détection de caillot par la méthode turbidimétrique. [43]

• Le principe néphélométrique est utilisé par certains systèmes. Dans des tests de coagulation, une source de lumière laser monochromatique est transmise, par exemple, au moyen de fibres optiques. La lecture de la dispersion de la lumière est rendue possible par un capteur qui peut être installé à 90 ou à 180 degrés du trajet de la lumière, selon le système employé, qui mesure par la suite la lumière diffusée à un certain angle ou qui enregistre les changements de la transmission de la lumière. Lorsque la lumière atteint des complexes insolubles comme les fibres de fibrine, elle se disperse vers l’avant à des angles diffus (180 degrés) et à des angles diffus latéraux (90 degrés). Le chronomètre s’arrête lorsque la quantité de lumière diffuse ou de lumière transmise atteint un certain niveau prédéterminé. La différence entre la lumière diffuse ou transmise avant et après la formation du caillot est habituellement proportionnelle à la quantité de fibrine formée. [34]

Figure 17 : Détection de caillot par la méthode néphélométrique. A : un capteur installé à 180 degrés du trajet de la lumière, B : le capteur instalé à 90 degrés du trajet de la lumière. [43]

Détection électromécanique (Viscosimétrie) :

Elle repose sur le déclenchement d'un signal électrique lié à la modification de mobilité d'une bille associée au mélange réactionnel lors de la formation du caillot [62]. On a deux variantes de ce principe :

• La première utilise un champ électromagnétique appliqué aux cuvettes de test qui détecte le mouvement d’une sphère en acier inoxydable placée dans l’échantillon plasmatique. La sphère d’acier suit un mouvement de pendule, se balançant d’un côté à l’autre d’un mouvement continu dans un mélange de réactif et de plasma. Au fur et à mesure que la fibrine se forme, la viscosité augmente et le mouvement de la sphère est ralenti. Lorsque l’oscillation de la sphère atteint un niveau prédéterminé, le chronomètre s’arrête et indique le temps de coagulation du plasma.

• Une deuxième méthode de détection mécanique utilise également une sphère en acier inoxydable, placée cette fois dans un endroit précis. Un capteur magnétique détecte la position de la sphère et, alors que la cuvette tourne, la sphère maintient son inclinaison tant que l’échantillon liquide demeure fluide. Lorsque la fibrine est formée, le caillot s’empare de la sphère et la déplace de son emplacement initial. Lorsqu’elle sort de la portée du capteur, le circuit est interrompu et le chronomètre s’arrête. [34, 63]

Figure 18 : Méthode électromécanique utilisant un champ électromagnétique. [43]

Ces techniques sont reproductibles, elles ne sont influencées ni par les qualités optiques du plasma (ictère, hémolyse, lactescence...), ni par les qualités optiques de la fibrine pathologique (antipolymérases acquises ou dysfibrinogénémies). Elles permettent d'utiliser tous les réactifs, même s'ils ne sont pas parfaitement homogènes et limpides. [62]

b) La technique chromogénique :

Le principe de la méthode chromogénique ou amidolytique est basé sur l’usage d’une substance générant une couleur spécifique, appelée chromophore. Pour l’hémostase, le chromophore utilisé est la para-nitroaniline (pNA), ayant un pic d'absorbance à 405 nm. Le principe du test chromogène est fondé sur la liaison de la pNA à un oligopeptide synthétique (de 3 à 4 acides aminés). La pNA est fixée à une suite d’acides aminés qui imitent la séquence cible du facteur de coagulation activé que nous voulons déterminer. Le facteur de la coagulation coupe le substrat chromogène à un endroit précis dans une séquence définie d’acides aminés et libère la pNA.

L’intensité de la couleur jaune est proportionnelle à la quantité de pNA libérée. Celle-ci est mesurée par photodétection à une longueur d’onde de 405 nm. Plus la pNA est coupée et libérée, plus la capacité d’absorbance de l’échantillon augmente, ce qui entraine des changements plus importants dans la densité optique de la solution. [34, 43, 45, 64]

L’activité enzymatique des protéines de coagulation et d'autres substances peut être mesurée par la méthode chromogénique selon deux façons :

 Mesure directe: la densité optique est proportionnelle à l'activité de la substance à mesurer (par exemple, le dosage de l'activité de la protéine C)

 Mesure indirecte: l'enzyme à mesurer à un effet inhibiteur sur un autre enzyme cible qui a une activité dirigée vers le substrat synthétique. Dans ce cas, le changement de densité optique est inversement proportionnelle à la concentration de l'activité de la substance mesurée (par exemple, le dosage de l’anti-facteur X activé de l'héparine). [43]

Figure 19 : Dosage de l’activité de facteur VIII par la méthode chromogènique. [65]

Les méthodes chromogèniques utilisant des substrats synthétiques, sont applicables aux tests globaux de la coagulation (le temps de prothrombines (TP) et le temps de céphaline avec activateur (TCA)), et sont surtout utilisées pour le dosage spécifique des facteurs et des inhibiteurs de la coagulation. Leur domaine d’application comprend également la surveillance des traitements par l’héparine, et autres antithrombotiques. [45, 66]

c) La technique immunologique :

Les dosages immunologiques sont les nouveaux tests disponibles dans les laboratoires d’hémostase, et elles sont basées sur les réactions antigène-anticorps. [43]

Des microparticules de latex enrobées d’un anticorps spécifique contre l’analyte (l’antigène) à mesurer sont habituellement utilisées. Un faisceau de lumière monochromatique traverse une suspension de microparticules de latex. Lorsque la longueur d’onde est plus grande que le diamètre des particules en suspension, les particules absorbent une petite quantité de lumière. Cependant, lorsque les microparticules de latex enduites d’anticorps spécifique entrent en contact avec l’antigène présent dans la solution, elles adhèrent à l’anticorps en créant des liens entre les particules, ce qui produit leur agglutination. Lorsque le diamètre des particules agglutinées s’approche de la longueur d’onde du faisceau de lumière monochromatique, une plus grande quantité de lumière est absorbée. Cette augmentation de l’absorption de la lumière est proportionnelle à l’agglutination, qui, à son tour, est proportionnelle à la quantité d’antigène présent dans l’échantillon. [34]

Cette technique est utilisée pour mesurer un nombre important des protéines et des facteurs de la coagulation, mais n’est pas utilisée pour la détermination du taux de prothrombine (TP) et du temps de céphaline avec activateur (TCA). [43, 66]

Tableau IV : Avantages et inconvénients des méthodes de détection.[34]

Méthode Avantages Inconvénients

Mécanique • Aucune interférence de caractéristiques

physiques comme la lipémie ou de l’hémolyse

• Peut utiliser de petits volumes

d’échantillon et peut parfois analyser du sang total dans certains tests, ce qui élimine le besoin de centrifuger

• Impossible d’observer un graphique de la formation de caillot

• Peut poser des problèmes sur le plan de la détection du résultat final dans certains

échantillons contenant un taux de fibrinogène bas

Photooptique • Possibilité de voir graphiquement la

formation de caillots • Vérifications optiques pour

hémolyse/lipémie/ictère dans certains systèmes optiques

• Interférences due à la lipémie, à l’hémolyse, à l’hyperbilirubinémie ou à l’augmentation de protéines dans certains systèmes

• Certains systèmes peuvent éprouver de la difficulté à détecter les caillots lors de l’emploi de réactifs complètement transparents

• Des temps de coagulation très courts peuvent ne pas être détectés en raison du temps de latence précédant le début du monitorage

Néphélometrique • Peut mesurer les réactions

antigène-anticorps de protéines présentes en très petites quantités

• Limite le nombre de tests disponibles • Coût des réactifs

Chromogénique • Possibilité que les tests totalement

spécifiques soient plus faciles

• Possibilité de paramètres additionnels qui ne peuvent pas être mesurés par la détection d’un caillot

• Augmente le répertoire de tests possibles

• Améliorations possibles de la précision comparativement aux analyses à base de formation du caillot

• Limité par la longueur d’onde de l’instrument

• Nécessite de grands volumes à tester pour obtenir un ratio coûts bénéfice positif • Coût de l’instrument et des

réactifs

Immunologique • Permet l’automatisation de méthodes

manuelles chronophages et augmente le nombre de testspossibles

• Nombre limité de tests disponibles • Coût des instruments