Techniques en génétique moléculaire appliquées à l’épilepsie

Le génome humain est soumis à une dynamique mutationnelle qui résulte en un spectre complexe de variants de séquence et de structure de l’ADN, qui vont des altérations nucléotidiques simples (mutations ponctuelles) à des remaniements (variations du nombre de copies d’ADN), en passant par des expansions de répétition en tandem (Variable Number of Tandem Repeats VNTR, ou Short Tandem Repeats STR) [169]. L’identification des anomalies génétiques causales sous-jacentes à la maladie grâce aux nouvelles techniques en génétique moléculaire, permet une confirmation du diagnostic, un typage génétique précis, un conseil génétique approprié et un éventuel diagnostic présymptomatique ou prénatal [170]. Nous détaillons ici les techniques utilisées dans ce travail :

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8.3.1. Amplification génique in vitro par réaction en chaine (PCR)

Conçue en 1985 par Kary Bank Mullis6, cette méthode consiste à réaliser in vitro, la répétition d’un cycle de synthèse d’un fragment d’ADN. Elle permet d’amplifier de manière sélective une séquence d’ADN choisie, même si cette dernière est présente dans un mélange complexe d’autres molécules d’ADN, et sans avoir à la purifier au préalable.

Dans le premier cycle de PCR : les deux brins de l’ADN que l’on veut amplifier sont dénaturés par la chaleur (95°C). Une paire d’amorces spécifiques et complémentaires de l’extrémité 3’ est ajoutée. La température est ensuite abaissée à 55-65°C afin que ces amorces puissent s’hybrider, une amorce sur chaque brin, de part et d’autre de la région à amplifier. A partir de ces amorces, une ADN polymérase particulière, la Taq Polymérase, qui est thermorésistante, va synthétiser à 72°C un nouveau brin d’ADN en lisant la séquence du brin existant, cette étape est appelée « élongation ». A la fin du premier cycle, les deux brins d’ADN ont été copiés pour former deux fragments d’ADN double brin (Figure 6).

Dans les cycles suivants, les mêmes étapes sont répétées : séparation des brins par la chaleur, hybridation des amorces, et élongation par la Taq Polymérase. Le nombre de copies du fragment compris entre ces amorces augmente ainsi considérablement : au bout de 20 cycles, on obtient environ 106 copies et au bout de 30 cycles environ 109 copies. A cette étape, le produit de la PCR est appelé amplimère.

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Figure 6: Représentation schématique des différentes étapes d'un cycle de PCR

A partir de la réaction de PCR « classique » se sont développées de nombreuses méthodes dérivées, dont la RT-PCR et la Q-PCR :

- L’acronyme RT-PCR signifie « Reverse Transcriptase PCR ». C’est en fait une PCR réalisée sur un ADN complémentaire obtenu après transcription inverse d’un ARN [171]. - L’acronyme Q-PCR signifie « PCR quantitative ». Elle permet de suivre en temps réel l’évolution de la quantité d’ADN synthétisé lors de la réaction de PCR en utilisant des marqueurs fluorescents [172].

8.3.2. Hybridation Génomique Comparative sur micro-réseaux d’ADN et recherche de CNV

Cette technique récente constitue l’avancée la plus significative de ces dernières années dans le diagnostic des réarrangements chromosomiques. Elle repose sur le principe de la CGH (Comparative Genomic Hybridization) appliquée aux puces à ADN. Une puce à ADN est un support de quelques cm2, le plus souvent en verre ou en silice, sur lequel sont présents un grand nombre de fragments d’ADN simple brin. Ces fragments correspondent à des séquences d’ADN humain, appelées « marqueurs », réparties sur le génome en fonction des régions étudiées.

Lors de l’analyse par CGH-array, l’ADN du patient à analyser est comparé à l’ADN d’un témoin. Si une région chromosomique est délétée, elle apparaitra en moindre nombre chez le patient par rapport au témoin. A l’inverse, si une région chromosomique est

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dupliquée, elle apparaitra en plus grand nombre chez le patient par rapport au témoin [173]. Les déséquilibres génomiques mis en évidence par CGH-array sont dénommés

Copy Number Variants (CNVs).

En pratique, le principe de cette technique est le suivant : l’ADN du patient est marqué par incorporation d’un fluorochrome, et parallèlement, on marque l’ADN du témoin avec un deuxième fluorochrome d’une autre couleur. Ces deux ADN sont ensuite combinés puis déposés sur la puce : c’est l’étape d’hybridation. Les ADN marqués vont se fixer de façon compétitive sur leur séquence d’ADN complémentaire qui est présente sur la puce. Enfin, la lecture de la puce s’effectue à l’aide d’un scanner qui détermine les rapports d’intensité entre chaque fluorochrome et compare ainsi le nombre de copies de chaque ADN (patient et témoin) au niveau de chaque marqueur étudié (Figure 7) [174]. Cette analyse est aidée par l’utilisation des bases de données publiques de CNV mais il est fréquent qu’en complément, une étude familiale soit nécessaire. Aujourd’hui, la technique de CGH-array a supplanté le caryotype pour l’étude globale du génome en offrant une résolution 10 à 500 fois supérieure, et en donnant accès au contenu génique de la région remaniée.

Figure 7: Principe de la technique CGH-array [173]

8.3.3. Séquençage massivement parallèle

Les techniques de séquençage massivement parallèle également appelées séquençage à haut débit ou Next Generation Sequencing (NGS) ne sont pour le moment

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pas utilisées en diagnostic de routine mais constituent probablement les méthodes d’analyse du génome les plus prometteuses. Les termes «deuxième» et «troisième génération» sont synonymes de l’évolution des technologies depuis la méthode de séquençage direct de Sanger dite de «première génération» [175].

Trois technologies NGS à haut débit sont apparues de façon quasi simultanée : le pyro-séquençage (454 Life Sciences, Roche Diagnostics, Bâle, Suisse), le séquençage avec des terminateurs réversibles (HiSeq2000, Illumina/Solexa, Inc., San Diego, CA, USA) et le séquençage par ligation (SOLiDTM, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)(Figure 8) [176, 177].

Figure 8: Séquenceurs de deuxième génération7

Ces techniques permettent de déterminer la séquence complète d’un génome.

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Pour cela, la séquence est assemblée en utilisant les chevauchements entre les reads, pour former des contigs8. Elles permettent également de détecter les réarrangements chromosomiques et d’avoir l’équivalent d’un caryotype mais avec une résolution maximale, à la base près. Par ailleurs, elles peuvent déterminer pour chaque région chromosomique le nombre de reads générés. Si une région est délétée, ce nombre sera relativement moindre par rapport aux autres régions du génome, ce qui est en faveur d’une anomalie déséquilibrée. Le traitement informatique de cette très grande quantité de données nécessite des algorithmes lourds et de puissants calculateurs afin de réaliser leur assemblage puis leur analyse [178].

8.4. Bio-informatique et analyse du génome : Utilisation des banques de données