Analyses fonctionnelles

2.5.1. Synthèse de peptides

Le peptide sauvage (non pathogénique) : Human galanin1–30 wild type [hGal(WT)]: GWTLNSAGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS, et le peptide muté : Human galanin A39E [hGal(A39E)]: GWTLNSEGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS) ont été synthétisés au Département de Neurochimie (Laboratoires de neurosciences, Arrhenius), à l’université de Stockholm en Suède. Les peptides ont été synthétisés à 0,1 mmol sur un synthétiseur de peptides automatisé (Biotage® Initiator + AlstraTM). Le premier acide aminé a été fixé à la résine par l’anhydride. Toutes les autres réactions ont été effectuées à l’aide de OxymaPure/DIC DMF. Le clivage final a été effectué en utilisant le protocole standard (95% TFA/2.5% TIS/2.5% H2O). Les peptides ont été purifiés en phase inverse HPLC à l’aide de BioBasic C-8 column (Thermo Scientific, Sweden) et un gradient de 20–80% acéto-nitrile/eau contenant 0.1% TFA. L’identité des peptides a été analysée par MALDI-TOF mass spectrométrie Voyager-DE STR (Applied Biosystems) en mode linéaire positif, par l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique comme matrice.

2.5.2. Analyse de liaison des récepteurs par la méthode de déplacement

Les expériences de déplacement -ou de compétition- permettent de déterminer l’affinité d’un ligand non radioactif, et d’étudier de nombreuses molécules non radiomarquées et de les comparer entre elles dans des conditions expérimentales strictement identiques. Les expériences de compétition sont réalisées en présence d’une concentration fixe de ligand radioactif et de concentrations croissantes du ligand non radioactif à étudier. Ce type d’expérience permet de déterminer l’IC50 et la constante d’inhibition Ki, par l’équation de Cheng–Prusoff [351]: Ki = IC50 / ([L*]/KD), avec :

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- Ki : concentration en compétiteur froid, non radioactif, qui se lie à 50% des sites de liaison. Elle permet d’apprécier l'affinité de liaison de l'inhibiteur.

- IC50 : concentration du ligand non radioactif nécessaire pour déplacer 50% de la fixation totale du ligand radioactif.

- [L*] = concentration du radioligand libre ;

- KD : constante de dissociation du radioligand des récepteurs.

Plus Ki est faible plus l’affinité du ligand non radioactif pour le récepteur est élevée. Dans notre étude, les affinités de liaison des peptides galanine (sauvage et mutant) ont été comparées aux trois récepteurs membranaires GalR1, GalR2 et GalR3. Cette analyse a été effectuée sur un volume final de 200 μl contenant 0.15 nM du ligand radiomarqué 125I-galanin (2200 Ci/mmol; Perkin–Elmer Life Science, Boston, MA, USA), 30 μg de membranes cellulaires et différentes concentrations du peptide non radioactif (10−5, 10−9 M). Les solutions de peptides ont été mises dans des tampons supplémentés en 0.3% d’albumine sérique bovine (BSA). Les échantillons ont été vortexés à 37°C pendant 30 min et trempés dans une solution de polyéthylénimine à 0.3% puis filtrés par MultiScreen-FB filter plate (Millipore, Billerica, MA, USA). Les filtres ont été lavés trois fois avec un tampon et la radioactivité retenue a été déterminée par un compteur gamm (Tri-Carb Liquid Scintillation Analyzer, model 2500 TR; Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA) en utilisant le cocktail OptiPhase Supermix (Perkin–Elmer Life Science, Boston, MA, USA) comme liquide de scintillation (Figure 16). Les valeurs de IC50 des peptides ont été calculées à l’aide du logiciel Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) et converties en valeurs Ki par l’équation de Cheng–Prusoff [351].

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Figure 16: Protocole d’analyse de liaison des récepteurs Gal par la méthode de déplacement [219]

2.5.3. Analyse de la transduction du signal

La transduction du signal désigne le mécanisme par lequel une cellule répond à l'information qu'elle reçoit par des agents chimiques ou autres signaux, afin de réguler des phénomènes tels que la prolifération cellulaire, la différenciation ou l’apoptose. Les principales voies de transduction du signal au sein des cellules sont : la voie des MAP kinases (mitogen-activated protein kinase, MAPK), la voie PI3 kinase (phosphatidyl inositol-3 kinase), la voie JAK/STAT (Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription) et la voie d’activation du facteur de transcription NFκB (Nuclear Factor kappa B). Dans cette étude, la transduction du signal a été étudiée en évaluant l'aptitude à stimuler la production d'inositols phosphates (IPs) dans des cellules CHO20 exprimant le récepteur humain hGalR2.

2.5.4. Test xCELLigence d'impédance cellulaire

La technologie xCELLigence permet de suivre l’activité cellulaire en temps réel et en continu sans marquage préalable. Alliance de la microélectronique et de la biologie cellulaire, cette technologie permet la mesure d'impédance électrique cellulaire, c’est à dire l’opposition exercée par un tapis cellulaire au passage d’un courant alternatif sinusoïdal. Elle est mesurée dans des puits de culture dédiés, dans lesquels le fond est

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recouvert de microélectrodes d’or, en modifiant le flux électrique. Le spectre d’applications les plus développées sur ce système concerne l’étude de la prolifération, la viabilité, la différenciation, l’adhésion, la migration et l’invasion cellulaire, en passant par l’étude des changements de morphologie cellulaire ou l’analyse fonctionnelle de récepteurs. Dans notre étude, le système xCELLigence a été utilisé pour mesurer les changements de l’impédance cellulaire après stimulation du ligand. Pour cela, les cellules exprimant le récepteur hGalR1 ont été incubées à 20.000 cellules par puits sur une plaque de 96 puits (ACEA Biosciences Inc.) et placées dans la plateforme xCELLigence Cell Analyzer (Roche Applied Science) en temps réel à 37° et 5% de CO2. Après 24h d’incubation, les milieux de culture ont été remplacés par un tampon d'essai (HBSS contain- ing 0.1% BSA). Trois heures plus tard, le peptide hGal A39E a été ajouté à concentrations croissantes (de 0.1 nM à 10 μM) durant une heure, avant d’être stimulé par 100 nM de peptide sauvage hGal(WT). L’indice cellulaire a été contrôlé avant et après l'addition des peptides. Les relations dose-réponse ont été tracées à l'aide des valeurs moyennes de quatre réplicas. Les valeurs d'indices cellulaires ont été étalonnées en divisant l'indice cellulaire au moment de l'addition du ligand. L’analyse des données a été effectuée par le logiciel built-in xCELLigence System et les résultats ont été présentés par GraphPad Prism.

2.5.5. Test d'accumulation d’inositols phosphates (IPs)

Les cellules CHO exprimant de manière stable le récepteur humain GalR2 ont été cultivées dans des plaques à 12 puits jusqu'à confluence. Les cellules ont ensuite été incubées durant 24 h avec 1 Ci de [3H] -myo-inositol dans le milieu M-199 contenant 100 U ml-1 de pénicilline et 100 g ml-1 de streptomycine. Ces cellules ont été lavées deux fois avec le tampon HEPES Krebs Ringer (HKR) (5 mmol/l HEPES, 137 mmol/l NaCl, 2,68 mmol/l KCl, 2,05 mmol/l MgCl2, 1,8 mmol/l CaCl2, 1 g/l de glucose, pH 7,4) suivie de 10 min de pré-incubation dans 800 pi de tampon HKR avec 10 mmol/l de LiCl à 37 °C. Le peptide hGal (A39E) (10-5,10-8 M) avec ou sans hGal (WT) (10-7 M) a été ajouté à un volume final de 1000 l et incubé pendant 60 min à 37°C. La réaction a été arrêtée par addition de 200 l d'acide perchlorique à 20% pendant 10 min suivie par l'addition de 1,5 M KOH / 75 mmol/l HEPES (pH 7). La chromatographie par échange d'anions a été réalisée sur 1 cm 50:50 Dowex (AG 1-X8 Resin, 200- 400 mesh formate; BioRad, Hercules, CA, USA). Les colonnes ont été lavées avec 5 ml d'eau distillée, avant l’élution

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des IPs par 5 ml d'acide formique 0,1M/ 1,2M formate d'ammonium. La radioactivité de l'éluat a été déterminée par un β-compteur (Tri-Carb scintillation liquide Analyseur Modèle 2500 TR, Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA) en utilisant Utima Flo AF (Perkin-Elmer Life Science, Boston, MA, USA) comme fluide de scintillation. Chaque échantillon a été étalonné par rapport au nombre total obtenu avant la Chromatographie d'échange d'anions.

3. Résultats