Techniques de diagnostic direct :

a) culture cellulaire :

L’isolement du virus en culture cellulaire in vitro constitue la méthode de référence du diagnostic de la varicelle-zona pour les prélèvements cutanés et les biopsies, mais actuellement les techniques d’amplification génétique PCR (polymerase chain reaction) sont plus largement utilisées.

Le VZV est cultivable sur différents types de cellules: les lignées cellulaires les plus fréquemment utilisées sont les MRC5 (Medical Research Council 5), fibroblastes diploïdes provenant de poumon d’embryon humain et les cellules Véro.

Après filtration du prélèvement, le liquide filtré est mis en culture sur différents supports qui sont centrifugés pour améliorer la pénétration du virus, puis incubées sous CO2 à 37°C (62). Régulièrement, ces cultures sont

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examinées au microscope optique à la recherche d’un effet cytopathogène (ECP). Cet effet permet d’orienter le diagnostic vers un groupe ou une famille de virus. De même, la rapidité d’apparition de cet effet peut orienter un diagnostic. Pour le VZV, un délai de deux à sept jours est habituellement nécessaire pour observer les premiers foyers de l’effet cytopathique. Cependant, un délai de 12 jours est parfois nécessaire, reflet du faible titre viral dans le prélèvement initial ou d’une atténuation de l’infectiosité durant le transport du prélèvement. (2)

L’effet cytopathique caractéristique est formé de cellules de tailles inégales, éparpillées sur un foyer granuleux. Le virus est très associé aux cellules et reste en foyer (9). Mais le plus souvent, l’identification précise du virus n’est totalement confirmée que lorsque la culture cellulaire est couplée à des techniques de diagnostic indirect avec mise en évidence d’un antigène viral, en 48 heures, en utilisant un anticorps monoclonal par méthode d’immunofluorescence ou immunoperoxydase. (63).

La tentative d’isolement du VZV au cours du zona est régulièrement décevante car l’existence d’anticorps neutralisants intratissulaires réduit l’infectiosité du virus présent. Cette recherche chez un patient immunodéprimé est néanmoins utile car le résultat, s’il est positif, indique un très fort niveau d’immunodépression et participe à l’évaluation du pronostic de l’infection.

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A : effet cytopathique du virus varicelle-zona en foyer sur cellules fibroblastiques humaines (MRC5) (63)

B : Cellules rénales simiennes Véro (63)

 Avantages : Cette méthode offre l’intérêt, en cas d’isolement viral positif, non seulement de diagnostiquer la présence de virus mais également de prouver son caractère infectieux et contaminant (62). Elle permet également le diagnostic des infections asymptomatiques.

Il est à noter que dans certains cas, comme par exemple la récidive d’un zona après traitement correctement entrepris, la culture virale permet de réaliser un antivirogramme. (63)

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 Inconvénients : Cette méthode de diagnostique présente plusieurs limites. Les résultats dépendent directement de la qualité du prélèvement et de sa conservation jusqu’à l’inoculation (délai, température). La présence de pathogènes contaminants dans le prélèvement peut altérer le métabolisme cellulaire. Enfin, du fait que de faibles titres viraux sont difficilement détectables, l’absence d’isolement viral ne permet jamais d’affirmer la négativité du diagnostic. Le délai de rendu des résultats peut être long, il dépend du délai d’apparition de l’effet cytopathogène qui varie entre 3 et 12 jours.

Pour ces raisons, différentes techniques diagnostiques, en particulier les techniques de biologie moléculaire, tendent à supplanter l’isolement en culture de cellules. (62)

b) Microscopie électronique :

Cet examen ne permet de visualiser des virus qu’à la condition que ceux-ci se trouvent en quantité importante (supérieure à 106 particules par mL). De plus, l’aspect observé n’est révélateur que de la famille de virus mais pas de l’espèce, exemple: l’aspect microscopique distingue les herpès virus mais ne fait pas la différence entre un herpès simplex et un VZV [64].

 Avantages : C’est une technique facile et rapide.

 Inconvénients: Cette technique est chère, nécessite un matériel imposant et sans distinction entre HSV et le VZV. (63)

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Figure 25 : virus varicelle-zona en microscopie électronique

c) Immunofluorescence :

En cas d’éruption vésiculeuse, il est possible de mettre en évidence directement les protéines virales présentes (antigènes viraux), du fait de leur forte concentration dans ces lésions, grâce à des anticorps monoclonaux spécifiques anti-VZV. Cette technique permet un diagnostic rapide. Elle est réalisée à partir du prélèvement riche en cellules intactes non congelées. L’écouvillon est déchargé directement sur une lame en verre pour immunofluorescence ou immunoperoxydase, des anticorps monoclonaux prétitrés marqués à la fluorescéine ou à la peroxydase sont appliqués sur l’échantillon étalé sur la lame et incubés pendant 30 à 40 minutes à 37°C. L’anticorps non lié est ensuite extrait et la préparation colorée est disposée sur un support et examinée au microscope à fluorescence. La démonstration de la

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présence d’une coloration VZV positive dans le cytoplasme et le noyau de la cellule évoque fortement une infection par le VZV. Aucune fixation avant transport n’est requise. (2, 62, 65).

 Avantages : C’est un diagnostic rapide, simple et spécifique. Les conditions de conservation du prélèvement sont souples et ce test permet d’établir un diagnostic définitif 3 à 6 heures après la réception d’un échantillon clinique.

 Inconvénients : La positivité de cet examen dépend également de la qualité du prélèvement dermatologique et de l’expérience du lecteur des lames. La technique est délicatement réalisable et n’est pas actuellement automatisé. (63)

d) Détection de l’ADN viral par PCR :

L’apport des techniques de virologie moléculaire dans le diagnostic des infections à VZV est actuellement important et en cours d’évaluation dans un nombre considérable d’indications.

Pour le diagnostic direct, c’est l’introduction de l’amplification génétique par PCR dont la sensibilité surpasse celles de la culture et de la détection d’antigènes sur lame. Ainsi, la PCR requiert une faible quantité de prélèvement ce qui est intéressant pour le liquide céphalorachidien et les liquides intraoculaires (vitrée et humeur aqueuse). (9)

L’amplification génique ou PCR permet d’amplifier de façon très importante l’acide nucléique recherché à l’aide d’une ADN polymérase et

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d’amorces spécifiques. La mise en évidence d’un fragment de l’acide nucléique spécifique d’un virus donné peut alors être visualisée après coloration ou par hybridation spécifique avec une sonde interne.

Le rendement de la PCR dépend essentiellement de la qualité de l’extraction des acides nucléiques. (63)

Figure 26 : Courbes représentant les quantités d’ADN synthétisées en fonction du nombre de cycle d’amplification

 Formes cutanées :

La recherche d’ADN par PCR est possible à partir du frottis cutané (que celui-ci ait été coloré ou non), des prélèvements de vésicules, de croûtes et de biopsies cutanées ou d’autres organes. Le prélèvement peut être stocké de

plusieurs jours à +4°C à plusieurs années à -80°C. Un traitement du prélèvement préalable à la PCR est indispensable, comprenant au minimum une lyse

cellulaire, précédée pour les frottis colorés d’une extraction du fixateur, et suivie éventuellement d’une extraction des acides nucléiques. Plusieurs études ont

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précisé l’intérêt de la PCR dans les prélèvements cutanés, que les résultats de PCR soient comparés ou non à ceux de la culture.

On peut effectuer le PCR à partir du frottis, avec une sensibilité un peu réduite lorsque celui-ci a été fixé. C’est à partir des croûtes que la sensibilité de la PCR est la plus faible. Dans les formes cutanéomuqueuses atypiques où le diagnostic virologique est indispensable, en particulier chez l’immunodéprimé pour faire le diagnostic différentiel avec une infection à HSV, la PCR est utile lorsque la culture est non disponible ou négative, ce qui est le cas lorsque le patient est sous traitement antiviral.

La PCR a surtout un intérêt dans les formes compliquées d’infections à VZV et au cours de l’infection congénitale. En effet, dans les prélèvements oculaires, de LCR ou de liquide amniotique la culture n’est pas très sensible. (40)

 Formes compliquées:

L’infection à VZV peut être compliquée par sa localisation ophtalmique. Au cours du zona, il est intéressant d’observer la grande fréquence de l’atteinte oculaire lorsque l’éruption est généralisée ou concerne le visage, comme l’objective la positivité de la PCR de 25 à 75% des prélèvements conjonctivaux. Dans la kératoconjontivite, le VZV est détecté dans le grattage cornéen et éventuellement à partir de larmes prélevées sur un film. La mise en évidence de l’ADN par PCR est plus sensible que la mise en évidence de l’antigène ou du virus en culture. La PCR aide au diagnostic différentiel avec les kératites à HSV.

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Dans les nécroses rétiniennes aigues essentiellement dues au VZV et rarement à HSV, survenant particulièrement au cours du sida, le diagnostic repose sur la mise en évidence de l’ADN par PCR essentiellement dans l’humeur aqueuse, plus rarement dans le LCR. En cas de diagnostic autoptique, le VZV est retrouvé dans le nerf optique et la rétine.

La PCR prend tout son intérêt dans les divers syndromes neurologiques sans éruption en participant à la reconnaissance de réactivation à VZV sine herpele (c’est-à-dire sans éruption) ou dont l’éruption est retardée.

Chez les patients infectés par le VIH, le VZV est responsable d’un spectre varié de manifestations neurologiques dont certaines sont l’apanage de l’immunodéprimé comme la leucoencéphalite multifocale et la ventriculite. En revanche chez ces sujets, la mise en évidence de l’ADN du VZV par PCR dans le LCR ne témoigne pas toujours de la responsabilité du VZV dans la symptomatologie mais probablement d’une réactivation asymptomatique, d’autres agents pathogène étant dans ce cas retrouvés.(40).

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Tableau IV: intérêts de la PCR pour le diagnostic Des infections à VZV.

prélèvement Limites du diagnostic virologique classique

Indications (prélèvements)

LCR Culture peu sensible synthèse intrathécale retardée

- Zona avec signes neurologiques, zona facial - Syndrome neurologique +/- éruption

 Méningite aigue aseptique

 Encéphalite chez l’immunodéprimé

 Myélite et méningo-radiculite

 Neuropathie

 En cours d’évaluation : syndrome de Hunt, vascularite

- Névrite optique : en cours d’évaluation oculaire Culture impraticable en

raison du petit volume disponible

- Zona ophtalmique (conjonctive) - Syndrome oculaire +/- éruption

 kératoconjonctivite (grattage cornéen > film larmes)

Nécrose rétinienne aigue (humeur aqueuse et vitrée)

cutané Effet cytopathique identique des infections à VZV et à HSV sur frottis Négativation des cultures sous antiviral

- Diagnostic différentiel VZV, HSV

 lésion vésiculeuse

 lésion atypique

 chez l’immunodéprimé

- Etudes épidémiologiques : infection nosocomiale, éruption après vaccination. Liquide

amniotique

Culture peu sensible Varicelle maternelle dans les 24 semaines d’aménorrhée.

sang Sensibilité limitée Impraticabilité de l’immunocytodiagnostic

Chez l’immunodeprimé, symptomes inexpliqués (précédant l’eruption), compatibles avec une infection à VZV.

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En situation épidémiologique, la caractérisation des acides nucléiques par étude du polymorphisme de restriction et l’analyse du nombre de séquences répétées (de R1 à R5) permet de distinguer les souches sauvages de la souche vaccinale. Néanmoins, pour analyser une épidémie, nosocomiale par exemple, la différentiation des souches sauvages entre elles est difficile, en raison de la très grande stabilité génétique du VZV.

 Caractéristiques : Pour être appliquée à une utilisation diagnostique, certaines caractéristiques de la PCR doivent être impérativement vérifiées. D’une part, le fragment amplifié est choisi dans une région spécifique du VZV en particulier vis à vis des autres Herpesviridae et dans une région constante génétiquement pour détecter la totalité des souches de VZV. D’autre part, un soin extrême doit être apporté pour éviter les contaminations en particulier par les produits amplifiés.

Enfin, les études par PCR imposent d’étudier des liquides biologiques non hémorragiques et d’éliminer une contamination vasculaire dans l’étude des biopsies tissulaires.

 Avantages :

 la technique la plus sensible avec une faible quantité de prélèvement.

 Le résultat dépend moins des conditions de transport et de conservation.

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 Avec la PCR en temps réel, le résultat peut être rendu dans les deux heures qui suivent le prélèvement.

 Inconvénients : risque de contamination (faux positifs), présence d’inhibiteurs (faux négatifs) dans certains prélèvements, ce qui nécessite un manipulateur expérimenté.

3.3 Diagnostic indirect

Les techniques de diagnostic indirect sont destinées à mettre en évidence des anticorps spécifiques du VZV témoins d’une réaction immunitaire humorale, développé au cours d’une varicelle ou zona, récente ou ancienne. Elles sont habituellement pratiquées sur du sérum, plus rarement sur d’autres liquides biologiques (LCR, humeur aqueuse…).

Plusieurs méthodes immunologiques sont utilisées pour visualiser la présence d’anticorps anti-VZV, la méthode ELISA est la plus utilisée. Les techniques d’agglutination au latex et fixation du complément permettent également de poser le diagnostic qui présente peu d’intérêt en pratique thérapeutique, car il est tardif.

B. ELISA

La technique ELISA est un test qualitatif et quantitatif pour la caractérisation des anticorps anti-VZV dans le sérum, le plasma ou le liquide céphalorachidien. L’ELISA d’IgM est utilisé pour la caractérisation d’une infection aigue. La caractérisation des IgG sert au diagnostic des infections récentes et passées, à la détermination de l’immunité, ainsi qu’à la détection des

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anticorps formés dans l’espace intrathécal, dans le diagnostic du LCR. L’ELISA des IgA sert en particulier au diagnostic des réactivations.

Lorsque le dosage est effectué conformément au mode d’emploi, ses résultats conjugués à d’autres informations cliniques peuvent contribuer à déterminer l’état immunitaire et/ou aider au diagnostic d’infections par VZV. Ce test est réservé à un usage diagnostic in vitro.

 Principe de l’analyse ELISA :

Par la technique indirecte ELISA, les surfaces internes des puits de la microplaque sont recouvertes de l’antigène correspondant. Les anticorps spécifiques présents dans l’échantillon du patient se lient à ses antigènes fixés à une phase solide. Pour rendre la réaction sérologique visible, on ajoute des anticorps de caractérisation marqués par des phosphatases basiques, et dirigés contre l’immunoglobuline humaine fixée à l’antigène du prélèvement du patient dans le cas positif. (66)

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En ajoutant du substrat (para-nitrophényl phosphate), il se produit une réaction enzyme-substrat qui donne un produit final coloré en jaune. L’intensité de la coloration jaune est établie par photométrie, celle-ci étant proportionnelle à la teneur en anticorps spécifiques.

 Avantages: Rapidité (délai 5 heures), lecture automatique de densité optique.  Limites:

- aucun diagnostic ne doit être rendu sur la base des seuls résultats de l’essai ELISA. Les résultats des tests doivent être interprétés en conjonction avec une évaluation clinique et les résultats d’autres procédures diagnostiques.

- Les résultats positifs de sang prélevé au cordon ombilical ou sur des nouveau-nés doivent être interprétés avec prudence.

- Un résultat réactif chez un patient immunodéprimé n’indique pas nécessairement une infection antérieure par le virus de la varicelle. - Les caractéristiques de performance avec des personnes vaccinées par le

VZV (souche OKA) n’ont pas été établies.

- Prix de revient plus élevé que l’immunofluorescence.