Techniques de quantification et d’analyse

3.3.1. Fixation et immunomarquage des cultures primaires de

neurones, astrocytes et cellules musculaires

Après le temps de traitement souhaité, les cellules sont fixées à l ‘aide d’une solution d’éthanol à 95 % et d’acide acétique à 5 % pendant 5 min à -20 °C. On pratique ensuite deux lavages au PBS azide. Les cellules sont perméabilisées par traitement avec une solution de saponine à 0.1 % pendant 15 min ; puis les cellules sont incubées pendant 2 h avec les anticorps primaires dilués dans du PBS contenant 1 % de SVF et 0.1 % de saponine. Les anticorps primaires sont révélés avec un anticorps de chèvre anti-souris marqué à l’Alexa 488 ou un anticorps de chèvre anti-lapin marqué à l’Alexa 568, l’un et l’autre dilués au 1/400ème dans du PBS contenant 1 % de SVF et 0.1 % de saponine ; les préparations sont incubées pendant 1 h à température ambiante. On pratique ensuite deux lavages au PBS azide.

3.3.2. Fixation et immunomarquage des cocultures nerfs muscle

Après que le temps fixé pour les traitements est écoulé, les cocultures sont traitées par une solution à 500 nmol/L d’α-bungarotoxine couplée à l’Alexa fluor 488, pendant 15 min à 37 °C. Les cellules sont ensuite lavées 2 fois avec du PBS puis fixées avec une solution de paraformaldéhyde (4 %, pH 7,3) pendant 20 min à température ambiante. On procède

Antagonistes / inhibiteurs Effets Concentrations (µmol/L) Solvant de dissolution Incubation Fournisseur Référence

BAPTA chélateur sélectif des ions calcium 0.020 milieu de culture 1h avant la toxine molecular probes B1214

ifenprodil inhibiteur des sous sous-unités 2B des récepteurs NMDA 1, 2.5, 5 , 10 DMSO 1h avant la toxine sigma-aldrich I2892

mémantine antagoniste des récepteurs extrasynaptiques du NMDA 5, 10, 15, 20 eau 1h avant la toxine sigma-aldrich M9292

MK801 antagoniste sélectif non compétitif des récepteurs du NMDA 5, 10, 20 DMSO 1h avant la toxine sigma-aldrich M107

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ensuite à deux lavages au PBS azide. Puis on perméabilise les cellules par traitement avec une solution saponine à 0.1 % pendant 15 min et on les laisse pendant 2 h au contact de l’anticorps primaire anti neurofilament, dilué dans du PBS à 1 % de SVF et 0.1 % de saponine. L’anticorps primaire est révélé par un anticorps de chèvre anti-souris marqué à l’Alexa 568, dilué au 1/400ème dans du PBS contenant 1 % de SVF et 0., % de saponine qu’on laisse agir pendant 1 h à température ambiante.

La liste des anticorps utilisé figure dans le Tableau 6

Tableau 6 : Liste et origine des anticorps utilisés dans nos études.

3.3.3. Analyses d’image

L’intégralité de chaque puits de culture marqué est automatiquement prise en photo avec l’ImageXpress à un grossissement x 20. Pour chaque condition (6 puits de culture), 20 champs par puits (représentant 80 % de la surface totale du puits) sont automatiquement analysés à l’aide du logiciel Custom module editor MetaXpress. Le logiciel permet

notamment de déterminer le nombre total de neurones, le nombre de neurones

coexprimant différents marqueurs, la longueur du réseau neuritique. La figure 10illustre ce qu’il est possible d’analyser grâce à ce logiciel.

Anticorps Clone Isotypes Fixation Concentration Fournisseur Référence

Amyloid fibril OC Polyclonal rabbit IgG Acide acetique 1/2000 Milipore AB2286

alpha- bungarotoxine conjugué à l'Alexa fluor 488 cellules vivantes 500 nmol/L Molecular probes B13422

Beta Amyloid 6E10 Mouse IgG1 isotype Acide acetique 1/1000 Covance SIG-39320-0500

Acide acetique 1/500 Sigma Aldrich C8487

WB 1/25 cell signaling 9662

Cytochrome C (CytC) Polyclonal rabbit IgG Acide acetique 1/100 Abcam ab90529

glial fibrillary acidic protein (GFAP) Polyclonal rabbit IgG Acide acetique 1/400 Abcam G9269

glucose transporter 1 (GLUT-1) Polyclonal rabbit IgG WB 1/50 Sigma Aldrich SAB45020803

GSK-3 beta (27C10) Polyclonal rabbit IgG WB 1/25 cell signaling 9315P

Methionine sulfoxide (MetO) Polyclonal rabbit fraction anti serum Acide acetique 1/100 Novus biologicals NBP1-06707

Microtubule associated protein (MAP-2) HM-2 Mouse IgG1 isotype Acide acetique 1/400 Sigma Aldrich M4403

Myosin My-32 Mouse IgG1 isotype Acide acetique 1/400 Sigma Aldrich M4276

Neurofilament 200KDa N52 Mouse IgG1 isotype Paraformaldéhyde 1/400 Sigma Aldrich N0142

Oligomer A11 Polyclonal rabbit IgG Acide acetique 1/500 Invitrogen AHB0052

Post synaptic density 95KDa (PSD95) 6G6-1C9 Mouse IgG2a isotype Acide acetique 1/100 Abcam ab2723

SIRP alpha/CD172a (OX-41) Mouse IgG2a isotype Acide acetique 1/500 Novus NB100-65530

synaptophysine Polyclonal rabbit IgG Acide acetique 1/100 Abcam ab7837

Tau Phospho SER212 / Thr214 AT100 Mouse IgG1 isotype Acide acetique 1/100 Invitrogen 11818711

TDP43 Polyclonal rabbit IgG Acide acetique 1/100 ozyme 3448S

89 Photo originale

(Marquage Map-2)

Segmentation du réseau neuritique

Segmentation des corps cellulaires MAP-2 positifs Figure 10 : exemple d’analyse d’image

3.3.4. Evaluation des flux calciques

La sonde fluorescente Fluo 4AM est diluée (4 µmol/L) dans du milieu de culture et incubée en présence des cellules pendant 30 min à 37 °C. Les cellules sont ensuite lavées avec du milieu de culture.

On injecte alors de l’Aβ à l’aide des injecteurs du glomax (Promega). La mesure du niveau de calcium intra cellulaire (toutes cellules confondues) est faite juste après l’injection, puis à 1, 2, 5 et 10 min par mesure de la fluorescence (Exc 490 nm / Emm 510-570 nm).

3.3.5. Dosage du glutamate

Le glutamate est dosé dans les surnageants de culture au moyen d’un test « amplex red glutamic acid ». L’acide L-glutamique est oxydée par la glutamate oxydase pour produire de l’α-ketoglutarate, du NH3 et de l'eau oxygénée. La L-alanine et la L-glutamate-pyruvate transaminase sont inclus dans la réaction pour régénérer l'acide L-glutamique par

transamination de l’α-ketoglutarate, ce qui conduit à multiplier en de nombreux cycles la réaction initiale et à amplifier significativement l'eau oxygénée produite. L'eau oxygénée réagit avec le 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Rouge) dans un rapport

stœchiométrique de 1:1. La réaction est catalysée par la HRP (horseradish peroxydase)pour produire de la fluorescence.

Les réactifs sont incubés pendant 1 h à 37° C avec les échantillons. La fluorescence produite est ensuite mesurée (Exc 530 nm, Emm 600nm)

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3.3.6. Dosage des oligomères de peptide Aβ

Les AβO sont dosés dans le surnageant de culture à l’aide d’un test ELISA permettant la quantification préférentielle de peptides Aβ sous leur forme oligomérique. Les plaques sont avec un anticorps de capture monoclonal de souris anti-Aβ (MOAB-2), un anticorps de détection MOAB-2 biotinylé conjugué à la streptavidine HRP. L’adjonction d’un substrat de l’HRP (3,3 ', 5,5 ' - tetramethylbenzidine, TMB) fait apparaitre une réaction colorée dont l’intensité est directement proportionnelle à la concentration d'AβO. L’absorbance de la solution est mesurée à 450 nm.

3.3.7. Dosage de cytokine (TNF alpha, IL-1β et IL-6)

Le TNFα, l’IL-6 et l’IL1β sont titrés dans les surnageants de culture à l’aide d’un test ELISA. Les plaques sont « précoatées » avec un anticorps monoclonal spécifique du TNFα ou de l’IL-6 ou de l’IL1β. Les échantillons sont déposés dans les puits. Pendant la première incubation, les échantillons et l’anticorps biotinylé sont simultanément incubés. Après lavage, l’adjonction de TMB produit une réaction colorée, comme on l’a déjà dit, dont l’intensité est directement proportionnelle à la concentration de la cytokine d’intérêt. L’absorbance de la solution est mesurée à 450 nm.

3.3.8. Absorption du glucose

L’absorption du glucose est étudiée par à une méthode de bioluminescence non-radioactive, fondée sur la détection de deoxyglucose-6-phosphate (2DG6P). Quand le 2-deoxyglucose (2DG) est ajouté aux cellules, il est transporté à travers la membrane et il est rapidement phosphorylé, de la même manière que le glucose. Cependant, les enzymes qui dégradent le glucose, glucose-6-phosphate (G6P), ne peuvent pas dégrader le 2DG6P et ainsi cet analyte s'accumule dans la cellule. Après une période brève d'incubation, une solution de lyse est ajoutée aux cellules. La luminescence des échantillons est alors mesurée.

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3.3.9. Quantification de protéine par western blot

Les échantillons sont lysés avec du « CelLytic ». La quantité de protéine est

déterminée à l’aide d’un test BCA. Les lysats sont dilués au 50ème dans du PBS et mélangés à volume égal avec le réactif BCA. Les solutions sont incubées à 60° C durant 1 h et la quantité de protéine est mesurée à 562 nm avec un spectromètre Nanovue ; la concentration est déduite de la comparaison avec la gamme de BSA (Bovin Serum Albumine).

Les solutions sont diluées dans de l’eau distillée à 1 mg/mL de protéine. Chaque échantillon de protéine est chauffé pendant 5 min à 95° C.

Les échantillons sont préparés selon les recommandations de Protein Simple

(www.proteinsimple.com).

5 µL de préparation sont déposés dans les puits de la plaque à 384 puits prévus à cet effet. L’analyseur Simon ™ est préparé en ajoutant le tampon de séparation de la matrice, le tampon de lavage et le tampon de migration. Les capillaires et la plaque à 384 puits contenant les échantillons, les anticorps et les matrices sont alors placés à l'intérieur de l'instrument. L’instrument remplit les capillaires des différentes matrices de concentration et de séparation puis des extraits de protéine. Les échantillons sont alors séparés par

application d’un courant de 250 V pendant 40 min et immobilisés ensuite aux parois des capillaires. La matrice de séparation est retirée grâce au tampon spécifique.

Les capillaires sont alors lavés avec le tampon de lavage et bloqués avec le diluant

d'anticorps pendant 15 min. Ensuite, les anticorps primaires sont incubés dans les capillaires pendant 2 h, les anticorps secondaires conjugués à l’HRP sont incubés pendant 1 h. Après lavage, le luminol-S/ substrat de peroxyde est incubé dans les capillaires et le signal chimio-luminescent est détecté en utilisant le Dispositif Couplé de charge (CCD). L'analyse de données est effectuée en utilisant le Logiciel Compass (ProteinSimple).

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