Techniques de cryoconservation 56 

III.2.1. Utilisation de cryoprotecteurs

Par définition, les cryoprotecteurs sont des composés protégeant les cellules des lésions liées à la formation de glace et aux chocs osmotiques produits lors de la congélation et également de la décongélation. Les cryoprotecteurs sont des composés chimiques naturels ou de synthèses capables d’abaisser la température de congélation. Ils contiennent en effet des groupements électronégatifs capables de former des ponts h ydrogènes avec les molécules d’eau. Ainsi, si les molécules d’eau sont liées au cryoprotecteur, leur mobilité diminue et la viscosité de la solution augmente, avec pour c onséquence une diminution du ta ux de cristallisation (Meryman, 1971).

On distingue 2 catégories de cryoprotecteurs : les cryoprotecteurs pénétrants dits intracellulaires et les cryoprotecteurs non pénétrants dits extracellulaires.

III.2.1.1. Cryoprotecteurs pénétrants

Ce sont des substances organiques très solubles et de petit poids moléculaire. En pénétrant à l’intérieur des cellules, ces cryoprotecteurs limitent les « effets de solution » en diluant la fraction liquide intracellulaire (Meryman et al., 1977). Les cryoprotecteurs pénétrants les plus utilisés en biologie de la reproduction sont :

- Le diméthyl sulfoxide (DMSO, PM : 78 Da). Excellent solvant des corps gras, il traverse facilement les membranes cellulaires.

- Le 1,2-propanediol ou propylène glycol (PrOH, PM : 76 Da). Dialcool pénétrant rapidement les membranes cellulaires et montrant une grande stabilité à l’état amorphe.

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- Le glycérol (PM : 92 Da). Trialcool. La pénétration de ce cryoprotecteur à l’intérieur des cellules se fait par un mécanisme actif et non par simple diffusion. Il augmente la résistance membranaire à la congélation.

III.2.1.2. Cryoprotecteurs non pénétrants

Ce sont des sucres ou des polymères de haut poids moléculaire. Utilisés en combinaison avec les cryoprotecteurs intracellulaires, ils a méliorent la déshydratation cellulaire en entraînant une hyper-osmolarité extracellulaire et diminuent ainsi les risques de cristallisation intracellulaire. Ils se co mportent également comme des « tampons osmotiques » en évitant une réhydratation cellulaire trop rapide au moment de la décongélation.

Parmi les sucres de haut poids moléculaire, les disaccharides tels que le sucrose et le tréhalose sont les plus uti lisés. Le polyvinylpyrrolidone (PVP), le polyéthylène glycol (PEG), le ficoll et le dextran sont les polymères les plus utilisés.

III.2.1.3. Toxicité des cryoprotecteurs

Si l’utilisation des cryoprotecteurs est indispensable pour protéger les cellules contre les effets délétères de la congélation, ils peuvent être à l’origine de 2 types de cytotoxicité :

• Une toxicité par stress osmotique, liée à la dé shydratation cellulaire pendant l’exposition aux cryoprotecteurs. Cette toxicité peut être réduite par une exposition progressive des cellules aux cryoprotecteurs avec des bains de concentrations molaires croissantes.

• Une toxicité biochimique propre à ch aque cryoprotecteur. Elle dép end de la concentration en cryoprotecteurs et de la durée d’exposition. Cette toxicité peut êtr e réduite en diminuant la durée et/ou la température d’exposition et en cas d’utilisation de mélanges de cr yoprotecteurs par diminution de leur con centration respective. Des études ont en effet montré que l’utilisation d’une combinaison de cryoprotecteurs tels que le formamide et le DMSO, pe rmettait de limiter leur cytotoxicité respective (Fahy, 2010).

Introduction bibliographique



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III.2.2. Vitesse de congélation

A partir des t ravaux réalisés en bi ologie cellulaire, 2 tec hniques principales de cryoconservation peuvent être utilisées : la congélation dite « lente » avec descente en température contrôlée, et la vitrification exigeant un refroidissement ultrarapide.

III.2.2.1. Congélation lente

Lors de la congélation lente d’une cellule, plusieurs étapes sont à distinguer : - Le refroidissement en phase liquide (pente R1)

- La phase de congélation (pente R2)

- Le refroidissement en phase solide (pente R3) (Figure 10).

Pendant le refroidissement en phase liquide, les cellules sont e n suspension dans le milieu contenant le(s) cryoprotecteur(s). La vitesse de refroidissement ne doit pa s être trop rapide (-1 à -2°C/min) afin de fa voriser les échanges osmotiques de part et d’autre de la membrane cellulaire. La température de cette première phase descend de la température initiale T1, jusqu’à la température de surfusion TS à une vitesse de l’ordre de -1 à -2°C/min (pente R1). A

ce niveau, les cellules sont en suspension dans le milieu en phase liquide instable. Ainsi, tout choc mécanique ou thermique provoque la formation du 1er cristal. La cristallisation étant une réaction exothermique, la température du milie u remonte brutalement jusqu’à la valeur T2, température de congélation de la solution. La valeur de TS est imprévisible. Elle ne peut être

déterminée au préalable et est variable d’un essai à l’autre. Plus la valeur TS est basse, plus

l’amplitude du pic de surfusion sera grande et l’écart entre la température TS et la température

T2 élevé. Pour limite r cela, la formation du crista l de glace, le seeding, peut être induite délibérément à une température légèrement en d essous de l a température de fusion/cristallisation. A cette température les cristaux extracellulaires vont se former av ant la formation de cristaux intracellulaires, la concentration en solutés dissous a ugmente rapidement dans le compartiment extracellulaire et l’équilibre osmotique se rétablit par un mouvement d’eau hors d e la cellu le permettant une déshydratation intracellulaire préalable (Karlsson and Toner, 1996).

Ts : température de surfusion

R2 : pente de la descente en température de l’échantillon en phase de congélation T2 : température de cristallisation de l’échantillon

R3 : pente de la descente en température de l’échantillon en phase solide T3 : température de fin de cristallisation

Introduction bibliographique



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Après l’étape de seeding, la descente en température est réalisée de façon contrôlée à vitesse dite lente (de l ’ordre de -0,1 à -2°C/min, pente R2) ; c’est la pha se de congélation de l’échantillon.

La déshydratation cellulaire s’arrête lorsque la cristallisation est achevée. Après la température de fin de cristallisation (aux alentours de -50°C, T3), la vitesse de refroidissement peut être plus rapide (de l’ordre de -10 à -50°C/min, pent e R3) sans effet délétère. En effet, en dessous de cette température, la membrane devient imperméable à l’eau ; c’est le refroidissement en phase solide (Karlsson and Toner, 1996). Après avoir atteint la temp érature de -150°C, l’échantillon peut alors être plongé dans l’azote liquide pour c onservation à -196°C ou e n vapeur d’azote à -160°C (Figure 10).

III.2.2.2. Vitrification

La vitrification est une méthode congélation dite « non à l’équilibre » qui consiste en un passage direct de l’état liquide à l’état solide amorphe. La technique de vitrification nécessite l’utilisation de cryoprotecteurs à haute concentration (aux alentours de 5 à 8 M ) pour obtenir une viscosité importante du milie u extracellulaire et intra cellulaire afin de réduir e au maximum le temps entre le point de fusion et la température de nucléation. Ceci évite la formation de cristaux de g lace lors de la pl ongée dans l ’azote liquide et réalise un ét at amorphe ou état vitreux (Pegg, 2010). La vitesse de refroidissement doit être très rapide (entre 15 000 et 30 000°C/min) pour éviter l’apparition de centres de nucléation. Dans la pratique, ces vitesses de refroidissement ultrarapide sont a tteintes en plongeant l’échantillon dans de l’azote liquide (Camus et al., 2006).