La production de gamètes in vitro, mythe ou réalité ? 51 

Le développement d’un système de production in vitro de gamètes à partir de cellules souches humaines aurait un impact considérable sur l’évolution des connaissances fondamentales de la folliculogenèse et permettrait d’envisager le développement de nouveaux moyens de préservation de la fertilité.

II.6.1. Production d’ovocytes à partir de cellules souches embryonnaires

Chez la souris, Hubner et al. ont rapporté pour la pr emière fois l’obtention d’ovocytes dérivés de cellules souches embryonnaires (mCSE) (Hubner et al., 2003). Dans les mCSE, les auteurs ont réalisé une ex pression ciblée du facteur de transcription Oct4 ΀gcOct4-GFP (green

fluorescent protein)΁, exprimé dans les cellules pluripotentes puis dans les cellules de la lignée

germinale. Après 7 jours de culture in vitro des mCSE gcOct4-GFP, une rare population cellulaire exprimant des marqueurs spécifiques de la lignée germinale précoce tels que c-kit,

Ddx4 (DEAD box polypeptide 4 également appelée Vasa), et SCP3 (synaptonemal complex protein 3) a été isolée. Après culture in vitro de ces cellules isolé es durant 12 jours, d es

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cellulaires ont une morphologie tridimensionnelle typique des follicules et les ovocytes sont entourés d’une ZP. Les ovocytes expriment les marqueurs ovocytaires ZP1, ZP2 et ZP3 ainsi que le facteur GDF-9. D’autre part, ils expriment les enzymes de la stéroïdogenèse et sécrètent de l’œstradiol. Leur stimulation par PMSG ( pregnant mare serum gon adotropin) et hC G (human chorionic gonadotropin) induit l’extrusion des ovocytes et la formation d’une structure de type globule polaire suggérant l’achèvement de la première division méiotique. Enfin, un développement parthénogénétique des embryons jusqu’au stade blastocyste a été observé à partir de ces ovocytes (Hubner et al., 2003).

Chez l’humain, des structures de type follicule ovarien ont é té obtenues après 21 jours de culture de CSE humai nes (hCSE) s ans ajout d’inducteurs spécifiques. Cependant, ces structures ont rapidement dégénéré (Chen et al., 2007). Plus récemment, Aflatoonian et al. ont obtenu par culture de hCSE en présence de facteurs testiculaires néonataux, des structures de type ovocyte ainsi que des structures de t ype folliculaire exprimant les facteurs GDF-9 et

SCP3. Néanmoins, aucune protéine constitutive de la ZP n’a été mise en évidence

(Aflatoonian et al., 2009; Lacham-Kaplan et al., 2006).

Une ébauche de diff érenciation en g amètes féminins à partir de CSE est donc possible. Cependant, la fonctionnalité des ovocytes ainsi formés reste à démontrer chez l’humain.

II.6.2. Production d’ovocytes à partir de cellules souches germinales adultes

En 2004, Johnson et al. ont remis en cause le dogme selon lequel chez les mammifères, la femelle possède un st ock de cellules g erminales défini à la naissance. Leurs travaux ont mis en évidence au niveau de l’épithélium ovarien de souri s adultes, la présence de cellules de forme ovoïde, mitotiquement actives et exprimant la protéine Mvh ( murine vasa homologue également appelée DEAD box polypeptide 4 , Ddx4), marqueur spécifique des cellules de la lignée germinale (Johnson et al., 2004). Plus tard, Zou et al. ont mont ré que ces cellules souches germinales (CSGs) putatives, isolées à partir d’ovaires murins adultes par tri cellulaire magnétique à l’aide d’un anticorps anti-Mvh, étaient capables d’être maintenues en culture in

vitro et de prolifé rer plus de 6 mois. Par a illeurs, la transplantation de CSGs isolé es et

infectées par un virus po rteur du gène GFP dans des ovaires de souris adultes stérilisées par chimiothérapie, a permis de restaurer leur fertilité dans 80 % des cas (18/22) avec la naissance de souriceaux en bonne santé exprimant le transgène GFP (Zou et al., 2009). Néanmoins, ces

Introduction bibliographique



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travaux ont été discutés en raison de la méthode utilisée pour l’isolement des CSGs. En effet, le tri c ellulaire par billes magnétiques ne garantit pas la pureté de la population cellulaire isolée. En outre, l ’analyse de l ’expression de g ènes ovocytaires (Nobox, Zp3 et Gdf-9) a démontré que la population de CGSs isolées à partir d’ovaires murins adultes par la technique de tri cellulaire magnétique n’était pas pure mais contaminée par des cellules ovocytaires. De plus, cette méthode n e prend en compte qu’un seul critère de tri et ne permet donc p as de distinguer les CSGs viable s des CSGs morte s ou a ltérées (White et al., 2012; W oods and Tilly, 2012). Très récemment, White et al. ont optimisé l’isolement des CSGs par la technique de tri c ellulaire (fluorescence-activated cell sorting, FACS) permettant une sélection plus spécifique des CSGs vi ables exprimant la proté ine MVH. In vitro, les CSGs ainsi isolées (5-8 µm de diamètre) à partir d’ovaires de souris adultes peuvent proliférer en culture plus de 18 mois, et génè rent spontanément de l arges cellules sphériques (35-50 µm de diamètre ) exprimant des marqueurs ovocytaires tels que Gdf-9, Zp1-3 et Lhx8. Après transduction par un rétrovirus exprimant la GFP, les CSGs-GFP+ _{ont été transplant ées dans les ovair es de}

5 souris sa uvages. L’analyse histologique a montré la présence de follicules ovariens contenant un ovoc yte GFP+ _{dans les ovaires m urins 5 à 6 mois après la transplantation.}

23 embryons, dont 8 p orteurs du transgène GFP, ont été obtenus ap rès fécondation des ovocytes matures recueillis dans l’oviducte après stimulation ovarienne de ces souris.

Ces mêmes auteurs sont parve nus pour la p remière fois à isoler des CSGs à partir d’échantillons ovariens recueillis chez 6 jeunes femmes (22 à 33 ans). Les CSGs humaines présentent des caractéristiques morphologiques et d’expression génique similaires aux CSGs murines avec une prolifé ration observée sur plus ieurs mois en culture. Les CSGs isolées par tri cellulaire, ont été insérées dans un fragment de tissu ovarien hum ain qui a ensuite été greffé chez des souris f emelles immunodéprimées NOD-SC ID (non-obese diabetic/severe

combined immunodeficient). L’analyse histologique réalisée 7 et 14 jours après x énogreffe a

montré la présence de follicules primordiaux et primaires contenant un ovoc yte GFP+ démontrant leur provenance des cellules souches injectées dans le tissu ovarien. Néanmoins, un nombre important d ’ovocytes ne portaient p as cette marq ue, suggérant qu'ils étaient probablement déjà présents dans le tissu ova rien avant l'injection des cellules souches

(Figure 9).

Ces travaux, sous réserve d’être confirmés, présentent un intérêt thérapeutique majeur puisque l’expansion et la différen ciation des CSGs isolés à partir de l’épithélium ovarien, permettrait d’obtenir une quantité importante d’ovocytes qui, après autogreffe ou m aturation in vitro et

(DEAD box polypeptide 4) ont été isolées de l’épithélium ovarien par tri cellulaire (FACS,

fluorescence-activated cell sorting), puis infectées par un virus porteur du gène GFP (green

fluorescent protein). Les CSGs-GFP+_{ont été ensuite insérées dans du cortex ovarien puis greffées}

chez des souris femelles immunodéprimées NOD-SCID (non-obese diabetic/severe combined

immunodeficient). L’analyse histologique a montré 7 et 14 jours après xénogreffe, la présence de

follicules primordiaux contenant un ovocyte GFP+ _{démontrant leur provenance des cellules}

souches insérées dans le tissu ovarien. Modifié d’après White et al., 2012.

Introduction bibliographique



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FIV, permettraient de restaurer la fertilité de patientes à risque d’IOP. Il faut cependant rester prudent, il ne peut pas être exclu que quelques follicules primordiaux aient été prélevés au moment de l’isolement des CSGs puis transfectés par la GFP.