2 Matériaux et méthodes
2.3 Techniques de caractérisation de la microstructure
2.3.1 Techniques classiques utilisant les rayonnements photoniques
2.3.1.1 Mesure de la transparence des matrices fibrillées
Afin de déterminer la transparence des matrices, des fines bandes de 500 µm d'épaisseur et de 3 mm de large sont découpées et placées dans des cuvettes (Make) remplies d'eau Milli-Q. Une cuvette uniquement remplie d'eau sert de référence. Les mesures sont effectuées avec un spectrophotomètre UVIKON XL. A partir de l’absorbance mesurée pour la référence et l’ensemble (collagène + eau), on obtient l’absorbance de l’échantillon par la formule :
Équation 2-1
En tenant compte de l'épaisseur d de l'échantillon (en mètre), la densité optique monochromatique de l'échantillon est donnée par :
56
Équation 2-2
La densité optique moyenne est alors définie par la moyenne des D( ) pour compris entre 380 nm et 780 nm. Finalement, la transparence d'un échantillon est calculée en utilisant la relation suivante :
Les mesures de transparence ont été faites tous les deux jours du premier au vingtième jour. Par la suite, les mesures ont été effectuées environ 2 semaines après la synthèse des matrices afin que leur maturation soit suffisante.
2.3.1.2 Microscopie à lumière polarisée
Lumière naturelle. Une onde lumineuse est une onde électromagnétique, c’est-à-dire
composée d'un champ électrique et d'un champ magnétique . Ces champs sont perpendiculaires entre eux et se situent dans un plan perpendiculaire à la direction de propagation : le plan d'onde. La direction de caractérise la polarisation d'une onde. Dans la lumière naturelle, le vecteur varie de façon aléatoire au cours du temps. Elle n'est donc pas polarisée.
Polarisation rectiligne
.
Lorsque la direction de reste constante dans le plan d'onde, la polarisation est dite rectiligne. En munissant le plan d'onde d'un repère Oxy, le vecteur s'écrit :Équation 2-3
Soit l'angle entre et l'axe Ox. En z = 0, on a alors :
Équation 2-4
Polarisation elliptique
On parle de polarisation elliptique quand l'extrémité du vecteur décrit une ellipse dans le plan d'onde. Soient a et b les demi-axes de l'ellipse, l'ellipticité est alors définie par : .
L'ellipse est dite droite si l'extrémité de tourne dans le sens horaire et gauche si elle tourne dans le sens trigonométrique.
Les équations horaires des composantes sont alors :
Équation 2-5 avec = 1.
57 Si le grand axe de l'ellipse OX fait un angle avec l'axe Ox on a :
Équation 2-6
Polarisation circulaire. La polarisation circulaire est un cas particulier de la
polarisation elliptique. On l'obtient quand a=b, on a donc :
Équation 2-7
La microscopie à lumière polarisée permet de visualiser les différentes phases cristal-liquides formées par les différentes conditions physico-chimiques lorsqu'elles sont concentrées dans les microcellules. La source de contraste est la biréfringence du collagène. Le microscope utilisé est un Nikon Eclipse E600L avec une caméra digitale DXM 1200 CCD. Pour visualiser les phases cristal-liquides, les microcellules étaient placées horizontalement entre polariseurs croisés. Entre ces polariseurs, une solution isotrope de collagène apparaît noire alors qu'une solution organisée anisotrope de collagène est colorée et texturée. Ceci est dû à la biréfringence du collagène. La biréfringence est la capacité d'un matériau cristallin anisotrope (le spath d'Islande par exemple) à diviser la lumière incidente en deux rayons séparés de polarisations croisées. Avec le collagène organisé en phase cristal-liquide, on rencontre le même phénomène : la lumière en le traversant est dédoublée en un faisceau appelé ordinaire et un autre dit extraordinaire qui ne suit pas les lois de Descartes. Cette double réfraction est liée au fait que, dans la phase cristal-liquide ou dans le cristal, il y a une direction particulière que l'on appelle axe de biréfringence où l'indice de la direction ordinaire (généralement appelé n0) diffère de l'indice dans les directions perpendiculaires (appelé indice extraordinaire et noté ne). Ces indices dépendent de la longueur d'onde de la lumière. La biréfringence d'un corps peut être quantifiée par la valeur : .
Les milieux biréfringents étant optiquement anisotropes, la vitesse de l'onde lumineuse va varier avec la direction considérée du rayon. Quand les polariseurs sont croisés, c'est-à-dire à 90°, les rayons provenant du premier polariseur sont absorbés par le second, d'où l'extinction de la lumière. Ceci ne change pas si un corps isotrope est placé entre les deux polariseurs. La lumière se propageant dans un corps anisotrope peut être décomposée en deux composantes suivant les axes de l'ellipsoïde des indices (Figure 2-5).
58 Figure 2-5 : Ellipsoïde des indices
En présence d'un tel corps, la lumière a une intensité I' qui s'écrit :
Équation 2-8
où I' est l'intensité lumineuse à la sortie de l'analyseur (orienté à 90°), I l'intensité à la sortie du polariseur et l'angle formé entre le polariseur et le plus grand axe de l'ellipsoïde des indices c'est-à-dire ne (indice extraordinaire), le retard de phase de la composante vibrationnelle parallèle au polariseur par rapport à la composante parallèle à l'analyseur qui dépend du corps observé. Enfin est la longueur d'onde de la lumière. Ainsi, les variations d'intensité observées en un même point dépendent uniquement de l'angle c'est-à-dire de l'orientation de l'ellipsoïde des indices par rapport à l'axe du polariseur. L'intensité maximale sera obtenue pour des valeurs de telles que : c'est-à-dire = /4.
De la même façon, l'intensité sera nulle pour : soit pour = 0 ou = /2. Quand un corps anisotrope tel qu'une phase cristal-liquide est observée au microscope à lumière polarisée, la rotation de la platine sur laquelle repose l'échantillon, fait varier l'angle .
Ainsi la biréfringence est positive lorsque la vitesse de propagation de la lumière est plus rapide suivant l'axe ordinaire de l'ellipsoïde.
59 Figure 2-6 : Exemple de phase cristal-liquide formée dans une microcellule et observée au microscope à lumière polarisée. Cette phase est obtenue avec la condition 23. Elle est dite en contreplaqué puisque l’alternance de bandes brillantes et sombres signifie la présence d’angles. importants (proche de 90°) entre deux couches de molécules.
2.3.1.3 Tomographie par cohérence optique
Basée sur des méthodes interférométriques à faible cohérence en lumière infrarouge, la tomographie par cohérence optique (OCT : Optical Coherence Tomography) permet une visualisation 3D des échantillons sans préparation particulière et offre une bonne résolution axiale (de l'ordre du µm). Cette technique est utilisée pour étudier la cornée (Feng & Simpson, 2005; Latour et al., 2010) et nous l'avons appliquée pour observer nos matrices (avec cellules) et en déterminer l'épaisseur.
Figure 2-7 : Image OCT d'une matrice avec cellules stromales intégrées. On peut voir une image de la matrice dans toute son épaisseur.