Obtention des solutions de collagène

Les paragraphes suivants décrivent comment sont obtenues les solutions de collagène servant à l’élaboration des cornées artificielles.

2.1.1 Extraction du collagène

Le collagène de type I utilisé provient de tendons de queues de rats. Une fois extraits, les tendons sont immergés dans une solution de PBS 1x (pH 7,4) sous agitation, puis les résidus de vaisseaux sanguins les plus visibles sont éliminés à la main. S'ensuivent alors plusieurs centrifugations afin d'éliminer les divers contaminants passés dans la solution de PBS lors de l'extraction. Celles-ci ne sont arrêtées que lorsque le surnageant est limpide. Des centrifugations dans du NaCl 4M provoquent un choc osmotique qui lyse les cellules restantes et fait précipiter des protéines de haut poids moléculaire. Pour éliminer le sel et autres résidus les tendons sont une nouvelle fois centrifugés dans du PBS 1x avec un lavage final dans de l'eau Milli-Q. Les tendons sont alors dissous dans de l'acide acétique 500 mM jusqu'à obtention d'une solution visqueuse de collagène I mélangé à d'autres biomolécules contaminantes. Pour purifier la solution et éliminer une partie de ces protéines contaminantes, nous induisons une première précipitation à une concentration en NaCl de 300 mM. Le tout est centrifugé à 21 000 rpm (tour.mn-1) (53343 g) pendant 3h à 10°C et le surnageant est récupéré. Nous induisons la précipitation sélective du collagène I en faisant monter la concentration en NaCl à 600 mM. La solution est centrifugée pendant 1 h à 4500 rpm (4922 g). Les culots sont récupérés puis solubilisés dans de l'acide acétique 500 mM. Afin d'éliminer le sel, plusieurs dialyses contre des solutions d'acide acétique 500 mM sont effectuées. Finalement, les derniers résidus et agrégats sont éliminés avec une centrifugation de 3h à 22 000 tour.mn-1. La solution obtenue est gardée dans des tubes stériles à 4°C et a généralement une concentration en collagène proche de 3 mg/mL. Cette concentration peut être déterminée précisément par dosage d’hydroxyproline.

2.1.2 Dosage de la solution de collagène

Le dosage du collagène correspond en réalité à la détermination de la concentration en hydroxyproline. Pour ce faire, un volume de 50 µL de solution collagène est mélangé à un

50 même volume d'acide chlorhydrique 37 % afin de libérer les hydroxyprolines. Le tout est placé dans une étuve à 106°C pour une nuit afin d'obtenir l'hydrolyse du collagène. Ensuite on procède à l'évaporation du mélange et le résidu obtenu est remis en solution dans 1 mL d'eau. Ce mélange est dilué avec de l'eau pour obtenir trois échantillons de 400 µL de différentes concentrations (1/40, 1/20, 1/10). Dans chacun de ces échantillons un volume de 200 µL de Chloramine-T, d'acide perchlorique et de DMBA (4 dimethylamino-benzaldehyde) est ajouté de sorte à provoquer une réaction qui va donner à chaque échantillon une couleur entre le jaune et le rouge relative à la quantité d'hydroxyproline présente. Enfin, l'absorption à 557 nm est mesurée pour chaque échantillon. Une courbe référence est obtenue pour une solution d'hydroxyproline dont la concentration est connue et égale à 20 µg/mL. Cette courbe permet de corréler la concentration d'hydroxyproline à l'absorption. En tenant compte de la dilution de chaque échantillon et sachant que la molécule de collagène de type I contient 13% d'hydroxyproline (hp), la concentration en collagène est calculée comme suit :

, où D est le facteur de dilution.

2.1.3 Pureté de la solution de collagène

La pureté de la solution est déterminée par une électrophorèse en conditions dénaturantes sur gels de polyacrylamide. Cela permet d'identifier les protéines présentes par leur poids moléculaire.

Préparation des gels de polyacrylamide

Il y a deux types de gels: un gel de concentration et un gel de migration. C'est la quantité de polyacrylamide qui définit la taille des pores dans le gel. Un gel de concentration à 4% en polyacrylamide et un gel de migration à 6% permettent de bien séparer les différentes chaînes polypeptidiques du collagène. Les gels contiennent également de l'ammonium persulfate et du TEMED car le premier induit la polymérisation et le second l'accélère. Les deux gels sont coulés l'un après l'autre entre deux plaques de verre maintenues verticalement, le premier coulé étant le gel de migration. La composition exacte des différents gels est donnée en Annexe 1.

Préparation des échantillons

Les échantillons ont un volume de 20 µL et correspondent à un mélange de 10 µL d'une solution de collagène plus ou moins diluée avec 10 µL de tampon d'échantillon. Trois dilutions différentes sont utilisées: une dilution 2,5, 5 et 10. Le tampon d'échantillon contient du SDS ce qui permet de dénaturer la molécule de collagène. Pour ce faire le mélange est chauffé durant 5 minutes à 100°C dans de l'eau bouillante. Ensuite on refroidit le tout pendant 5 minutes dans de la glace et les échantillons sont placés dans les puits du gel de concentration au côté d'un puits dans lequel est mis le marqueur de

51 poids moléculaire (SDS-6H, SIGMA). Le marqueur de poids moléculaire est introduit dans un des puits de sorte à pouvoir relier la distance de migration des molécules présentes dans la solution de collagène à un poids moléculaire.

Migration

L'ensemble du système (gels + échantillons) est immergé dans un tampon de migration et une différence de potentiel est appliquée entre la base du gel de migration et le sommet du gel de concentration. Tant que les échantillons sont dans le gel de concentration, la tension appliquée est de 80 V. Une fois dans le gel de migration, la tension est fixée à 120 V. Un gel issu d'une des purifications effectuées est présenté Figure 2-1.

Figure 2-1 : Gel d'électrophorèse en condition dénaturante. Les bandes les plus marquées sont caractéristiques du collagène. Les deux bandes du haut correspondent aux dimères 11 et 12 et les deux bandes les plus importantes aux brins 1 et 2. Concentrations décroissantes de gauche à droite.

Fixation et coloration

Pour fixer les protéines et les colorer, le gel est placé pendant 1 heure dans une solution de bleu de Comassie. Ensuite, afin de retirer l'excédant de Bleu de Comassie, le gel coloré est placé dans divers bains de décoloration contenant de l'eau, de l'éthanol et de l'acide acétique.

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2.1.4 Ajustement de la condition physico-chimique

La condition physico-chimique est définie par les concentrations en acide acétique et en acide chlorhydrique de la solution de collagène. Chaque condition est nommée par un numéro (voir Tableau 2-1). Les différentes concentrations sont ajustées par dialyses en utilisant une membrane de 12-14 kDa (Spectra Pore 12-14 000; 6,4 mL/cm). Au total, 28 conditions physico-chimiques ont été étudiées. Elles sont listées dans le Tableau 2-1 et la Figure 2-2. Le pH correspond au pH du mélange des deux acides.

Condition c(AA) c(HCl) pH 1 70 1,25 2,55 2 120 0,3 2,85 3 220 0,3 2,61 4 320 0,3 2,57 5 36 0,6 2,91 6 36 0,9 2,85 7 36 1,25 2,78 8 220 0,9 2,59 9 220 0,6 2,58 10 120 0,6 2,73 11 200 0 2,77 12 300 0 2,70 13 200 1,25 2,64 14 300 1,25 2,58 15 500 1,25 2,44 16 800 1,25 2,39 17 36 1,5 2,70 18 120 1,5 2,54 19 220 1,5 2,63 20 36 0,3 2,93 21 120 1,25 2,71 22 5 0,3 3,37 23 10 0,3 3,26 24 20 0,3 3,17 25 2 0,3 3,45 26 0 0,3 3,60 27 5 0 3,42 28 10 0 3,31

Tableau 2-1 : Conditions expérimentales. Ensemble des conditions physico-chimiques testées. Les concentrations des acides sont en mM. Le pH indiqué est celui des solutions de dialyse c'est-à- dire les solutions contre lesquelles la solution de base obtenue après purification est dialysée.

53 Figure 2-2 : Cartographie des conditions physico-chimiques testées.

En général, six bains sont effectués pour être certain que la solution à l'intérieur du sac de dialyse ait atteint la condition souhaitée.