Technique histologique

• Mise en cassette et fixation des pièces

Ces trois organes ont été coupés en de petites pièces de quelques millimètres à l’aide d’une lame de bistouri et mis dans des supports plastiques appelés cassettes d’inclusion, munis de couvercle. Les pièces ainsi apprêtées ont séjourné dans du formol à 10 % pendant 72 heures pour permettre une fixation totale.

• Circulation

Cette étape a consisté à remplacer toute l’eau contenue dans le tissu par de la paraffine afin de faciliter l’inclusion à la paraffine et les coupes. Elle comporte successivement trois opérations : la déshydratation, la clarification ou l’éclaircissement et l’imprégnation par la paraffine.

- La déshydratation

Pour déshydrater, les tissus ont été plongés successivement dans huit (08) bains d’alcool (éthanol) de concentration progressivement croissante (50° ; 70° ; 80° ; 90° ; 95° ; 100° x 3) à raison d’une heure par bain.

- La clarification

Elle a été faite en plongeant les prélèvements dans trois bains de xylène d’une durée d’une heure chacun. La manipulation a été effectuée sous une hotte chimique car le xylène est très toxique.

- L’imprégnation

Cette opération a été effectuée dans la paraffine fondue à une température légèrement supérieure à son point de fusion (50 et 60°C). A cette étape terminale de la circulation les pièces ont été passées successivement dans trois bains de paraffine à raison d’une heure par bain.

• Enrobage des pièces

L’enrobage a pour but de conférer à l’ensemble que doivent former la pièce et la paraffine qui l’imprègne une consistance homogène, celle de la paraffine solide.

Ainsi, les blocs sont formés.

Pour leur réalisation, il a été procédé de la façon suivante :

- Le tissu après circulation a été introduit dans un moule. La face sur laquelle la coupe a été réalisée est orientée vers le fond du moule métallique ;

- La paraffine fondue a été coulée sur le tissu ainsi orienté et bien centré dans le moule servant de support au bloc avant sa solidification ;

- Le moule métallique est ensuite surmonté de la cassette d’inclusion par la face postérieure de sa base.

La paraffine liquide a été complétée jusqu’au remplissage complet de l’ensemble moule/pièce/cassette. Ainsi la cassette s’est adaptée au porte-bloc du microtome pour permettre la coupe ;

- La solidification de la paraffine a été faite au réfrigérateur;

- Après solidification de la paraffine, le moule a été retiré et le bloc obtenu.

• Coupe des blocs (confection des rubans)

La coupe a été faite au microtome, lequel possède un porte-bloc où se place la pièce inclue. Pour obtenir les rubans, on a procèdé de la manière suivante :

- le porte-bloc a été orienté à l’aide des vis moletées afin que les surfaces inférieures et supérieures du bloc soient strictement parallèles au tranchant du rasoir et que, la surface du bloc soit en même temps verticale ;

- Le rabotage a été fait pour enlever la mince couche de paraffine qui recouvrait le tissu ;

- vient ensuite la phase de confection des rubans de tissu. Les minces coupes de tissu de cinq microns (5µm) d’épaisseur sont obtenues grâce à l’action rotationnelle qu’exerce le technicien sur la manivelle du microtome. Chaque section réalisée adhère à la suivante et permet d’obtenir à la fin un ruban.

• Etalement des rubans

La phase d’étalement a été réalisée comme il suit :

- sur une lame porte-objet recouverte d’une couche de liquide d’étalement (albumine glycérinée), on a déposé les segments du ruban de tissu précédemment obtenus ;

- l’ensemble a été placé sur une plaque chauffante réglée à une température de 50°C environ. La solution d’albumine a été chauffée et le segment du ruban s’est progressivement étalé. Les quelques plis qui persistaient ont été éliminés en tirant délicatement à l’aide de deux lancettes sur les bords du ruban ;

- après cet étalement, la préparation a été retirée de la plaque, puis inclinée dans le sens de la longueur sur du papier buvard pour enlever l’excès d’albumine ;

- la lame a été ensuite séchée pendant environ une heure dans une étuve dont la température a été portée à 40°C.

• Coloration et montage des lames

Les différentes étapes suivies se présentent comme il suit :

- déparaffinage par plongeon des lames successivement dans deux bains de toluène ou xylène pendant cinq (05) minutes chacun ;

- réhydratation des coupes par passage des lames respectivement dans des bains d’alcool (éthanol) à degrés décroissant 90°C, 70°C enfin dans l’eau distillée pendant 3 à 5 minutes dans chaque bain ;

- Coloration à l’hématéine pendant 15 minutes ; - Rinçage à l’eau de robinet pendant 5 minutes ;

- Différenciation des coupes dans le mélange alcool-acide 2 à 3 plongeons ensuite dépôt des lames dans un bain d’eau de robinet. Après observation au microscope les noyaux sont colorés en rouge et le fond reste clair ;

- Lavage à nouveau des lames à l’eau de robinet pendant 2 à 3 minutes - Plongeon des lames dans l’eau ammoniacale ;

- Lavage des lames à l’eau - de robinet pendant 15 minutes

- Coloration des lames dans la solution d’éosine pendant 15secondes à 2 minutes puis Rinçage à l’eau de robinet ;

- Déshydratation dans un bain d’éthanol à 70 °C pendant 30 secondes à 2 minutes puis Rinçage à l’eau de robinetEclaircissement au xylène pendant 30 secondes à 2 minutes

- Montage des lames à l’Eukitt.

• Etapes du montage des lames à l’eukit

Pour procéder au montage nous avons réalisé les activités ci-après:

- Sortir la lame du bain de xylène (l’éclaircissant) à l’aide d’une pince ;

- Nettoyer la lame pour le débarrasser des traces de colorant, en prenant soin de ne pas toucher les coupes de tissu ;

- Imprégner la lame de xylène ;

- Déposer deux à trois gouttes d’Eukitt sur la coupe colorée à l’aide d’une pipette ;

- Couvrir la coupe d’une lamelle;

- Veiller à ne pas emprisonner des bulles d’air entre la lame et la lamelle ; - Incliner légèrement et de façon perpendiculaire la lame sur du papier

buvard afin de recueillir l’excès de xylène ou d’Eukitt ; - Essuyer le revers de la lame sur le même papier buvard ; - Déposer la lame dans le plateau pour présentation de lames ; - Laisser sécher convenablement le liquide de montage.