L’étude a été réalisée dans trois différentes unités de recherche. Ces dernières sont situées dans les locaux de l’Institut des Sciences Biomédicales Appliquées (ISBA) à savoir:
l’Unité d’Enseignement et de Recherche en Physiologie de la FSS Cette unité a servi de cadre pour la mise en place du modèle expérimental morphologie tissulaire avant et après traitement.
le Laboratoire d’impact environnemental
Dans ce dernier nous avons effectué l’extraction aqueuse des feuilles de Newbouldia laevis et l’analyse phytochimique des extraits ainsi obtenus.
2.2- MATERIEL D’ETUDE 2.2.1- Matériel végétal
Il est essentiellement constitué des feuilles de Newbouldia laevis récoltées en décembre 2010 dans la localité d’Abomey Calavi au Sud du Bénin. Les feuilles récoltées ont été lavées et séchées à la température du laboratoire pendant trois semaines. Elles ont été ensuite réduites en poudre par broyage pour la réalisation de l’extraction.
2.2.2- Matériel animal
Des rats Wistar ayant un poids moyen de cent quatre-vingt (180) grammes et âgés de douze à seize semaines ont constitué le matériel animal de l’étude.
30
Ces animaux ont été élevés à l’animalerie de l’Unité d’Enseignement et de Recherche de Biologie Humaine de la FSS. Ils ont été gardés dans des cages métalliques et ont libre accès à l’eau et à la nourriture (Voir annexe 1).
2. 3- APPROCHES METHODOLOGIQUES Type d’étude
Il s’agit d’une étude expérimentale réalisée chez le rat Wistar. Elle a couvert la période allant de Novembre 2010 à Septembre 2011.
Les rats Wistar, bien portants et ayant un poids moyen de 180 grammes ont été sélectionnés.
Variables
Les principales variables à l’étude sont : - le poids ;
- la pression artérielle ;
- les paramètres biochimiques : créatinémie, l’ionogramme, la cholestérolémie et les transaminases
Procédure biologique
Les différentes étapes suivies au cours de notre étude ont été les suivantes : 2 .3.1- Extraction des feuilles de Newbouldia laevis
L’extraction a été réalisée à partir d’un mélange composé de 75mg de poudre de Newbouldia laevis et de 500ml d’eau distillée dans un ballon d’un litre de capacité, porté à ébullition pendant une demi-heure. Par la suite le filtrat a été récupéré à l’aide d’un entonnoir Büchner. Cette opération a été reprise une seconde fois dans les mêmes conditions. Le filtrat a été soumis à un processus d’évaporation sous pression réduite à 70°C dans un Rotavapor. Ce processus a conduit à l’obtention de pâte qui a été conservé à l’abri de la lumière et de l’humidité dans des flacons gardés dans un congélateur.
31
2.3.2- Etude phytochimique de l’extrait aqueux de Newbouldia leavis
L’analyse phytochimique a pour objectif d’identifier les familles de molécules présentes dans l’extrait. Nous avons procédé à la :
- détermination du système de migration de l’extrait à utiliser sur chromatographie sur Couche Mince (CCM),
- détermination de la concentration de l’extrait, - recherche des molécules dans l’extrait.
Détermination du système de migration
L’extrait a été testé dans plusieurs systèmes de migration afin de choisir pour chaque famille de molécule recherchée, le système de migration adéquat.
Il s’est agi de :
- acétate d’éthyle/Acide acétique/Acide formique/Eau distillée (100 :05 :05 :10) ;
- acétate d’éthyle /Acide acétique/Acide formique/Eau distillée (100 :11 :11 :26) ;
- acétate d’éthyle/Méthanol/Eau distillée (100 :17 :13) ; - acétate d’éthyle/Méthanol/Eau distillée (100 :13 :10) ; - acétate d’éthyle/Méthanol/Eau distillée (100 :13,5 :10) ; - chloroforme 100% ;
- chloroforme/Méthanol/Eau distillée (70 :30 :04) ; - chloroforme/Méthanol/Eau distillée (64:50 :10) ; - chloroforme/Méthanol/Eau distillée (65:25 :04) ;
- chloroforme/Acide acétique/Méthanol/Eau distillée (64 :32 :12 :08) ; - toluène/Ether/Acide acétique 10% (1 :1 :1) ;
- anydride d’acide/Acide sulfurique/Ethanol absolu (05 :05 :50)
32
Détermination de la concentration de l’extrait à déposer sur plaque Trois différentes concentrations ont été évaluées. Il s’agit de : 5mg /ml, 10mg/ml et 20mg/ml. Ces différentes concentrations ont été déposées sur une même plaque. Après migration et révélation au NP/PEG (Natural Products-Polyéthylène Glycol reagent) ou réactif de NEU, la visualisation des métabolites sur plaque CCM a été effectuée. La concentration de 20 mg/ml de l’extrait a été choisie du fait d’une bonne visibilité des spots sans un excédent au dépôt.
Recherche des molécules dans l’extrait
Nous avons utilisé deux méthodes pour effectuer ces recherches :
• La chromatographie sur couche mince ou sur plaque (CCM) qui est une adopté le 17 décembre 2001) [32].
A deux lots de 3 rats femelles nullipares non gravides a été administré l’extrait par voie orale. Elles ont été maintenues à jeun depuis la veille à 18h.
Les doses ont varié entre les quatre niveaux réglementaires fixés : 5 ; 50 ; 300 ; 2000 et exceptionnellement 5000 mg / Kg de poids corporel. La dose initiale choisie était de 300 mg /Kg de poids corporel.
33
- administration de la même dose à trois animaux supplémentaires,
- administration de la dose immédiatement supérieure ou inférieure à trois animaux supplémentaires. (voir annexe 3)
Les animaux ont été observés individuellement au moins une fois pendant les premières 30 minutes et régulièrement pendant les premières 24 heures après le traitement. Une attention particulière s’impose pendant les premières 4 heures et quotidiennement pendant 14 jours après l'administration de la substance, à l'exception des animaux qui sont morts au cours de l’étude [33].
Toutes les observations ont été enregistrées de façon systématique sur une fiche individuelle établie pour chaque animal. (Voir annexe 4)
Le poids des animaux a été pris chaque semaine. A la fin de l’expérience, les organes ont été prélevés pour une étude histologique.
Etude histologique sur l’estomac, le foie et le rein
Ces organes ont été automatiquement conservés dans du formol tamponné à 10 % pour la réalisation des coupes histologiques (voir technique en annexe 5).
Enfin la lecture a été faite par un spécialiste tout d’abord au faible grossissement (10x10) pour un examen global puis à un plus fort grossissement (40x10) pour les détails tissulaires.
34
Dosage des paramètres biochimiques (créatinémie, cholestérol, transaminase et ionogramme sanguin) choisie comme modèle d’HTA au cours de notre étude. Ainsi le L-NAME a été administré aux rats à la dose de 20 mg/Kg de poids corporel par voie orale à l’aide d’une sonde de gavage. L’induction a duré 7 jours, le poids des rats a été pris au départ et à la fin. La pression artérielle de chaque rat a été ensuite mesurée.
Technique de mesure de la pression artérielle
La technique par cathétérisme carotidien est celle utilisée pour la mesure de la pression artérielle. mélangé avec quelques gouttes d’anticoagulant (Enoxaparine)
- Trousse de dissection comportant : ciseaux, des clamps, des pinces, des écarteurs
- Bobine de fil à coudre Préparation de l’animal
L’animal a été anesthésié au thiopental à la dose de 40mg/kg de poids corporel en injection intra péritonéale. L’effet de l’anesthésie s’est installé après environ 3 à 5 minutes.
35
L’animal a été placé en décubitus dorsal sur la table de manipulation, il faut alors pincer la patte de l’animal à l’aide des doigts pour s’assurer de l’efficacité de l’anesthésie. La peau de la région cervicale de l’animal a été épilée puis nettoyée. On réalise une incision sur le plan médian de la partie supérieure du sternum jusqu’à environ 1 cm du maxillaire inférieur. Les glandes sub-maxillaires ont été écartées à l’aide de pinces, ce qui nous a permis de repérer l’artère.
Cathétérisme de l’artère carotide
Les différentes étapes du cathétérisme de l’artère ont été les suivantes:
- Ecartement des plans musculaires d’un côté de la trachée pour repérer les pulsations carotidiennes ;
- Dégagement de la carotide délicatement ;
- Dégagement du nerf pneumogastrique qui forme un cordon vasculo-nerveux avec la carotide ;
- Insertion de deux fils sous la carotide puis ligature du côté céphalique avec l’un des fils pour que le sang ne reflue pas ;
- Insertion du clamp pour arrêter provisoirement le sang ;
- Hémisection de la carotide et introduction du cathéter hépariné en direction du cœur ;
- Ligature avec le deuxième fil et enfin ouverture de la pince hémostatique tout en vérifiant qu’il n’y a ni vide ni fuite. (Voir annexe 7)
Mesure de la pression artérielle
Le cathéter introduit a été relié au moniteur qui intègre les valeurs de la PA nous permettant de lire les chiffres de la pression artérielle systolique (PAS) et diastolique (PAD)
Calcul de pression artérielle moyenne (PAM) La formule du calcul est la suivante : PAM= (2 PAD + PAS) / 3
36
2.3.5- Evaluation de l’efficacité de l’extrait Traitements
Après 7 jours d’induction de l’HTA par du L- Name, les rats ont été pesés puis soumis au traitement à base de feuilles Newbouldia laevis. Il s’est agi soit d’un extrait aqueux de feuilles Newbouldia laevis, soit d’une infusion préparée en versant 1000 mL d’eau distillée bouillante sur 100g de poudre de Newbouldia laevis.
La drogue de référence choisie comme contrôle positif était le captopril®, un antihypertenseur de la classe des IEC. Il a été administré à la dose de 100 mg/Kg de poids corporel. Les substances ont été administrées par voie orale à l’aide d’une sonde à gavage.
groupes expérimentaux
Les différents groupes expérimentaux sont constitués comme suit :
• Groupe 1 : lot témoin dont les rats n’ont rien reçu ;
• Groupe 2 : lot de rats traités par le L-NAME à la dose de 20 mg/Kg de poids corporel pendant 7jours et laissés au repos pendant les 7 jours suivants;
• Groupe 3 : lot de rats traités par le L-NAME à la dose de 20 mg/Kg de poids corporel pendant 7jours puis à l’extrait aqueux de Newbouldia laevis à la dose 200mg /Kg de poids corporel pendant les 7 jours suivants;
• Groupe 4 : lot de rats traités par le L-NAME à la dose de 20 mg/Kg de poids corporel pendant 7jours puis à l’extrait aqueux de Newbouldia laevis à la dose 500mg /Kg de poids corporel pendant les 7 jours suivants,
• Groupe 5 : lot de rats traités par le L-NAME à la dose de 20 mg/Kg de poids corporel pendant 7jours puis à l’infusion aqueuse de Newbouldia laevis (500 mg/ml/rat) pendant 7 jours ;
• Groupe 6 : lot de rats traités par le L-NAME à la dose de 20 mg/Kg de poids corporel pendant 7jours et par le captopril® à la dose de 100mg/Kg de poids corporel pendant les 7jours suivants ;
37
• Groupe 7 : rats traités par le L-NAME à la dose de 20 mg/Kg de poids corporel pendant 7jours laissés au repos pendant 14 jours ;
• Groupe 8: rats traités par le L-NAME à la dose de 20 mg/Kg de poids corporel pendant 7jours puis à l’extrait aqueux de Newbouldia laevis à la dose 500mg /Kg de poids corporel pendant 14 jours.
NB : Chaque groupe était composé de 8 rats
Le schéma du protocole se résume dans le tableau II suivant :
Tableau II: Les groupes expérimentaux dans chaque schéma de traitement Substances
(+) administration de la substance à tester
2.4- ANALYSE STATISTIQUE DES DONNEES
Le traitement des données a été réalisé grâce au logiciel SAS System. Le test statistique utilisé pour interpréter les résultats est le test de student.