Technique Expérimentale

1.3.2.1 Construction du plan de fabrication du bloc

La première étape de la technique des TMA est la construction du plan de fab-rication du bloc. Il s'agit de dénir une carte TMA décrivant l'échantillon à placer dans chaque case de la matrice lignes/colonnes du bloc. Illustré par la Fig. 1.2 le processus relaté plus en détails ci-dessous n'est qu'une description technique qui sous-tend un problème de conception complexe.

Fig. 1.2: Construction du plan de fabrication TMA - Pour les patients à inclure à l'étude, sont disponibles dossiers cliniques et blocs de biopsie. Sur une lame HES de chaque bloc sont repérées des zones d'intérêt où prélever des carottes. L'expertise technique de l'équipe permet de déterminer quelle carotte prélevée dans quelle zone d'intérêt de quel bloc biopsie donneur devra être insérée à

chaque jeu de coordonnées dans le bloc TMA.

La taille de la matrice du bloc TMA (nombre de lignes et colonnes) est dénie en fonction du modèle de bloc de parane qui recevra les carottes et du diamètre du prélèvement. Il s'agit alors de remplir la carte TMA vide.

Pour ce faire, une cohorte de patients à intégrer est dénie. Pour chacun des patients, sont disponibles leurs dossiers cliniques et des blocs de biopsie d'archive. Si elle n'est pas déjà disponible, une lame histologique classique de l'ensemble du bloc biopsie, marquée avec une coloration standard (Hématoxyline-Eosine-Safran ou HES) est réalisée. Cette coloration permet la révélation de la structure du tissu : l'hématoxyline marque les noyaux en violet foncé, l'éosine colore les cytoplasmes en rose et le safran fait ressortir les bres de collagène en orange. Un anatomopatholo-giste observe ces lames HES et dénit des zones d'intérêt, portions de l'échantillon où il juge qu'il serait pertinent de réaliser des carottes.

L'ensemble des informations disponibles (zones d'intérêt dénies par le pathol-ogiste, informations cliniques, etc.) sont alors mises à contribution en conjonction avec l'expertise de l'équipe technique pour déterminer, pour chaque emplacement dans la carte du bloc TMA, quelle carotte devra être insérée à cet endroit. La déni-tion de la carotte consiste entre autres en une descripdéni-tion précise de ses coordonnées de prélèvement, au sein d'un bloc biopsie particulier.

La réalisation raisonnée d'un plan de fabrication d'un bloc TMA est un problème complexe qui implique des choix expérimentaux à plusieurs échelles : au niveau patient, il faut dénir quels patients intégrer à l'étude ; au niveau bloc biopsie, la question est celle de la dénition des zones d'intérêt de leur intégration au bloc TMA ; au niveau d'une zone d'intérêt, il s'agit de choisir une méthode d'échantillonnage et en particulier dénir le diamètre des carottes et le nombre de répétitions à réaliser pour être représentatif.

En pratique, ces questions diciles sont en général laissées de côté et l'objectif est de constituer des blocs TMA pour l'ensemble du matériel biologique disponible, de révéler l'expression du maximum de molécules, constituant ainsi le pool de données le plus complet possible. Le problème se trouve alors déporté au niveau de l'exploitation des données.

1.3.2.2 Construction du bloc TMA

Le plan de fabrication du bloc TMA étant déni, il s'agit alors de réaliser le bloc en tant que tel, selon le processus décrit Fig. 1.3.

Le bloc de parane vierge receveur est installé au sein du microarrayer, appareil permettant tout à la fois la perforation du bloc receveur, le prélèvement des carottes dans les blocs donneurs et leur insertion dans les trous du bloc receveur. Le plan de fabrication est parcouru une ligne après l'autre, comme le fait une machine à écrire. Selon les instructions de ce plan, chaque échantillon est alors prélevé dans le bloc donneur correspondant, sous forme d'une carotte de tissu de 0.6 à 2mm de diamètre, à l'aide du microarrayer. Le trou correspondant est réalisé dans le bloc receveur, puis la carotte est insérée à son emplacement dans le bloc TMA.

Au nal, on obtient un jeu de blocs donneurs carottés, mais encore utilisables pour réaliser de nouvelles carottes ou des lames histologiques classiques, ainsi qu'un bloc TMA. La diculté majeure est ici purement temporelle, la réalisation des blocs étant une tâche longue et fastidieuse.

Fig. 1.3: Construction du bloc TMA - Pour chacun des blocs de biopsie et chaque emplacement de prélèvement dénis dans le plan de fabrication du bloc, une carotte est réalisée puis insérée à la position prévue avec un microarrayer, ici un modèle manuel. Le résultat nal consiste en blocs

biopsie perforés et un bloc TMA correspondant au plan de fabrication.

1.3.2.3 Réalisation des lames TMA

1.3.2.3.1 Réalisation des coupes

L'exploitation anatomopathologique du bloc TMA passe tout d'abord par la con-struction de lames TMA dites blanches, c'est-à-dire sur lesquelles aucune coloration n'a encore été réalisée, selon le processus de la Fig.1.4.

Pour réaliser ces lames blanches, le bloc TMA est coupé au microtome en lamelles de 5µm d'épaisseur, constituant un ruban de parane de coupes sériées. Les lamelles sont ensuite placées sur des lames de verre vierges. Le résultat est une lame TMA présentant une matrice de spots, chaque spot correspondant à la coupe d'une carotte. La nesse des coupes rend leur transfert sur la lame vierge délicat : la perte ou l'altération de spots n'est pas rare. L'utilisation d'un scotch spécial collé sur la coupe lors des manipulations permet de limiter la disparition ou la casse des micro-échantillons. Mais le recours à cette pratique ne garantit pas un résultat parfait.

Fig. 1.4: Construction des lames TMA - Des coupes sériées sont réalisées dans le bloc à l'aide d'un microtome, puis positionnées sur des lames de verre et collées.

1.3.2.3.2 Réalisation de l'immunomarquage

L'expression de diverses molécules impliquées dans les processus de cancérisation sont alors révélées comme illustré Fig. 1.5.

Fig. 1.5: Marquage des lames TMA - L'expression de molécules d'intérêt est révélée par immuno-marquage en utilisant un automate de coloration.

À l'aide d'un automate de coloration, qui permet le traitement en masse des lames et un contrôle précis de la durée des bains, les lames sont exposées à des anti-corps spéciques des molécules à étudier, selon les mécanismes d'immunohistochimie décrits dans le Paragraphe 1.2.2.2.2. Pour les molécules étudiées au laboratoire, le système révélateur est une réaction enzymatique qui conduit à une coloration marron du couple antigène/anticorps d'intérêt. Le dépôt d'une résine synthétique permet la protection des lamelles lors des manipulations futures.

Mais, malgré le recours à un automate, les colorations ne sont pas pour autant nécessairement homogènes d'un lot à l'autre, d'une lame à l'autre et même d'une partie de lame à l'autre.

1.3.2.3.3 Molécules étudiées

Dans le cadre des travaux menés au sein de l'équipe, quatre molécules impliquées dans les processus de cancérisation ont été étudiées : la β-caténine, la Cycline D1, le Ki67 et le Bcl2. Le Tab.1.1 résume les connaissances à propos de ces molécules. Leur rôle au sein de ces processus est en eet bien connu :

⋆ Certaines de ces molécules sont liées à l'augmentation de la prolifération cellulaire caractéristique des cancers :

⋆ β-caténine : cette protéine est produite à proximité de la membrane des cellules où elle joue un rôle dans l'adhésion cellulaire. Dans les cellules normales, elle est rapidement détruite dans le cytoplasme à proximité de la membrane et elle atteint rarement le noyau. Dans les cellules tumorales, son processus de destruction est altéré et elle migre à travers le cytoplasme jusqu'au noyau. Dans le noyau, elle active les gènes de molécules de la famille des cyclines, causant la production de molécules de cyclines,

⋆ Cycline D1 : c'est une protéine de la famille des cyclines dont la pro-duction est activée par la β-caténine. Elle est produite dans le cyto-plasme et migre vers le noyau où elle initie la division cellulaire,

⋆ Ki67 : cette protéine est présente dans le noyau des cellules actives, c'est-à-dire des cellules qui sont en cours de division ou se préparent à se diviser. Même si sa fonction exacte n'est pas précisément connue, elle est utilisée comme marqueur de la prolifération cellulaire : plus le nombre de cellules où le marquage en Ki67 est supérieur à 0 est grand, plus le nombre de cellules engagées dans le cycle cellulaire est grand,

⋆ La dernière molécule est liée à la perte des capacités d'apoptose, soit de mort cellulaire : Bcl2 est une protéine dont la présence dans le cytoplasme de la cellule empêche sa mort.

Tab. 1.1: Résumé des faits biologiques connus à propos des molécules étudiées.

Molécule Compartiment cellulaire Rôle

β-caténine Membrane, Cytoplasme, Noyau Cellules normales : produite près de la mem-brane et détruite - Cellules tumorales : migre à travers le cytoplasme jusqu'au noyau où elle initie a production des cyclines

Cycline D1 Noyau, Cytoplasme Produite dans le cytoplasme puis migre vers le noyau - Noyau : initie la division cellulaire et ainsi contribue à la prolifération cellulaire

Ki67 Noyau Marque les cellules en division et est ainsi le

témoin de la prolifération cellulaire