Pratiques classiques d'exploration de tissus

1.2.2.1 Introduction

L'anatomopathologie, en tant que spécialité médicale qui se consacre à l'étude macro- et microscopique des tissus pathologiques, est avant tout l'examen indispens-able pour établir un diagnostic et, en complément, intervient parmi les disciplines utilisées dans le cadre de la recherche en oncologie. Ces études tissulaires sont souvent

réalisées à partir de biopsies (fragments de tissus ou d'organes) qui, en oncologie, sont prélevées lors de l'ablation d'une tumeur. Ces fragments sont échantillonnés sur la pièce opératoire, an de vérier si l'ensemble des tissus pathologiques ont bien été retirés.

Ces prélèvements sont conservés par inclusion dans des blocs de parane ou par congélation. En ce qui concerne les biopsies disponibles pour les travaux de l'équipe, celles-ci sont stockées dans la parane. Certaines de ces biopsies peuvent en eet être mises à la disposition des chercheurs, en particulier quand plusieurs blocs et les dossiers cliniques complets des patients sont disponibles.

L'utilisation de ces biopsies dans des études anatomopathologiques nécessite la réalisation d'échantillons observables au microscope optique à partir des blocs, sous la forme de lames histologiques, ainsi que la révélation de l'expression de molécules d'intérêt, par exemple par immunohistochimie. Mais cette technique expérimentale présente un certain nombre de limites que la technologie des TMA vise à dépasser.

1.2.2.2 Technique expérimentale

1.2.2.2.1 Procédure classique d'obtention de lames histologiques

La réalisation d'études anatomopathologiques sur les biopsies d'archive contenant des tumeurs, ou du tissu jugé sain servant de référence, requiert tout d'abord, de façon courante, l'amincissement des échantillons trop épais pour être utilisés tels quels en microscopie optique. Cet amincissement est réalisé par le découpage, à l'aide d'un microtome, de lamelles de tissus très nes (5µm) qui seront ensuite placées sur des lames de verre, ou lames histologiques.

Il faut ensuite procéder à la coloration de chaque lame pour révéler les structures tissulaires et cellulaires ou évaluer la répartition et la concentration de molécules d'intérêt.

1.2.2.2.2 Une méthode courante d'analyse moléculaire : l'immunohis-tochimie

Une méthode couramment utilisée pour la localisation de molécules particulières dans les échantillons placés sur lames histologiques est l'immunohistochimie. Cette technique est basée sur les principes de la réaction antigène/anticorps du système immunitaire. Elle permet de localiser des antigènes (très souvent des protéines ou fragments de protéines) dans des tissus, cellules, organites cellulaires, etc. Le réac-tif principal est un anticorps dirigé contre l'antigène à marquer, anticorps qui a

été obtenu à partir de sérum d'un petit mammifère (lapin, cobaye...) dont l'organ-isme a préalablement été sensibilisé à l'antigène. Des traceurs xés directement ou indirectement sur cet anticorps permettent de voir la réaction. Par exemple, en immunouorescence, les anticorps incluent leur système révélateur, car ils sont eux-mêmes uorescents, alors qu'en enzymo-immunologie, c'est le produit d'une réaction entre une enzyme et le couple antigène/anticorps qui est coloré. Le schéma général d'une réaction immunohistochimique est exposé Fig. 1.1.

(a) (b)

Fig. 1.1: Immnunohistochimie : (a) Les diérentes composantes d'une immunoréaction. - (b) Image d'une lame histologique d'un cancer du côlon marquée pour révéler la β-caténine observée

au microscope optique grossissement X4.

Une immunoréaction est donc composée de trois éléments principaux :

⋆ la préparation (tissu, cellule, organite subcellulaire...) contenant l'antigène à étudier,

⋆ un anticorps dirigé contre l'antigène recherché,

⋆ le système révélateur qui permet de visualiser l'immunoréaction.

Techniquement, l'échantillon à étudier est placé dans une série de bains. Un bain con-tient l'anticorps, d'autres permettent de laver l'échantillon pour retirer les molécules qui ne se sont pas xées, d'autres enn permettent de xer le révélateur à l'anti-corps, en particulier en enzymo-immunologie, où l'anticorps n'inclut pas son propre système de révélation.

Une observation microscopique des lames histologiques marquées permet d'éval-uer la quantité et la localisation des anticorps xés au sein de la cellule et des tissus, et par extrapolation d'évaluer la présence de l'antigène correspondant. Par abus de langage, anticorps et antigène sont souvent confondus du fait du lien existant entre les deux, et on parle généralement d'un marqueur.

Bien que bien maîtrisées car utilisées en routine depuis de nombreuses années, ces pratiques présentent des limites qui ont conduit à l'émergence de nouveaux protocoles expérimentaux tels que les TMA.

1.2.2.3 Limitations de ces technologies

Ces manipulations, bien qu'elles soient d'un intérêt majeur pour la recherche, présentent plusieurs inconvénients dans un contexte d'exploration des processus de cancérisation. En particulier elles sont coûteuses en tissus d'archive, en réactifs et en temps, tout en induisant une variabilité inter-lames.

Tout d'abord, an de mener des études complètes en cancérologie, il faut disposer tout à la fois de matériel biologique et d'informations cliniques concernant le patient chez qui a été prélevé la tumeur ou le fragment de tumeur. Or, des échantillons biologiques associés à des dossiers cliniques complets sont des denrées rares. De plus, la coupe successive de lames conduit un jour ou l'autre à l'épuisement du bloc de biopsie dans lequel il n'est alors plus possible de réaliser de nouvelles coupes. Il faut donc utiliser les biopsies avec discernement lors des expérimentations, comme pour toute ressource non renouvelable.

Ensuite, les expériences permettant la mise en évidence de molécules, telles que l'immunohistochimie, ont un coût nancier important, lié à l'achat de matériel pour réaliser les coupes (microtome, automate de coloration, etc.), les bains, auxquels s'ajoutent les lames, les réactifs, les anticorps...

De plus, les manipulations sont aussi coûteuses en temps, même si certains matériels permettent le traitement semi-automatique et en masse de lots de lames histologiques pour les étapes de révélation, une fois l'échantillon placé sur une lame vierge.

Enn, les études incluant un nombre important de lames imposent leur traitement en lots successifs, de par les dimensions des matériels de marquage. Or il existe quasi systématiquement une certaine variabilité de marquage entre lots, même au sein du même laboratoire, avec le même matériel, et des bains réalisés par le même technicien. La comparaison de marquage entre lames appartenant à des lots diérents est donc biaisée, certaines lames étant dès l'origine plus marquées que d'autres.

Il paraît donc intéressant de mettre en place des systèmes permettant de réaliser tout à la fois des économies de tissus et des économies de réactifs. La miniaturisa-tion des échantillons et leur traitement en masse est l'une des soluminiaturisa-tions possibles à ce problème, induisant un compromis entre les économies et une potentielle perte d'information liée à la réduction en taille de l'échantillon. La technologie des Tis-sue MicroArrays paraît comme une technique qui a trouvé une bonne balance entre ces deux composantes du problème. Mais celle-ci fait émerger de nouveaux besoins d'assistance à sa réalisation et de gestion et exploitation des données, de telles tech-niques à haut débit bouleversant la pratique expérimentale. La complexité de ces problèmes méthodologiques et d'utilisation des données suggèrent le recours à l'outil informatique.

1.3 Une technologie innovante : les Tissue

MicroAr-rays

1.3.1 Introduction

La technologie des Tissue MicroArray vise à dépasser les problèmes posés par les méthodes classiques d'exploration de tissus par la miniaturisation des échantillons, selon des principes qui ont fait leurs preuves pour le prélèvement d'échantillons cylindriques dans le bois, les sols ou la glace, à l'aide d'une tarière. Au lieu de réaliser des coupes complètes de chaque bloc de parane contenant une biopsie, des carottes de tissu sont prélevées au sein de chaque biopsie et sont organisées au sein d'une matrice lignes/colonnes dans un nouveau bloc, qui est alors traité comme un bloc classique.

Les premières publications présentant la technique des Tissue MicroArrays et ses avantages par rapport aux méthodes classiques d'exploration de tissus datent de la n des années 90, avec des travaux tels que ceux exposés dans [Kononen et al., 1998,

Kallioniemi et al., 2001, Bubendorf et al., 2001].

Depuis cette période, des centaines d'articles utilisant ce procédé ont été pub-liés, majoritairement pour la caractérisation et l'analyse de marqueurs tumoraux. Quelques exemples typiques pourraient être [Lugli et al., 2004] qui explore l'expres-sion d'un marqueur selon l'organe, ou [Wu et al., 2003] qui étudie le rôle d'une molécule particulière dans la carcinogenèse colo-rectale et son lien avec le pronostic des patients. Plus rarement, la technologie est utilisée dans d'autres domaines que l'oncologie, par exemple dans [Wang et al., 2002] qui s'intéresse au domaine de la neuropathologie. Enn, les Tissue MicroArrays sont aussi proposés comme outils de contrôle qualité au sein du laboratoire [Packeisen et al., 2002], ou entre laboratoires [Diaz et al., 2004], puisqu'ils permettent une évaluation peu coûteuse et rapide de la variabilité de coloration sur des dizaines de types tissulaires à la fois, au sein d'une seule lame.

La technique expérimentale des TMA, décrite plus précisément dans la suite de cette section, commence par la construction d'un plan de fabrication du bloc TMA, puis la réalisation de ce bloc. Le bloc est alors traité comme un bloc biopsie standard, avec coupes et coloration des lames obtenues. L'exploitation des lames passe par une étape extensive d'acquisition de données qui sont alors utilisées dans des études statistiques, d'analyse de données, etc. Mais ces techniques, si elles permettent de dépasser certains problèmes posés par les méthodes classiques, posent encore des problèmes techniques et conceptuels dont la résolution partielle peut éventuellement être apportée par l'outil informatique.