Synthèse de NO par les NOS

Le NO est majoritairement synthétisé par les synthétases du monoxyde d’azote (NOS), une famille d’enzymes qui catalysent la transformation enzymatique de la L-arginine en L-citrulline grâce à l’O2 (Figure 15). Les NOS sont présentes dans l’organisme sous 3 isoformes majeures : la NOS neuronale (nNOS ou NOS1), la NOS inductible (iNOS ou NOS2) et la NOS endothéliale (eNOS ou NOS3). Une quatrième isoforme mitochondriale (NOSmt) est également rapportée dans la littérature, mais son existence demeure controversée (voir Chap2/II/2.1). Ces isoformes différent principalement par i) leur localisation dans la cellule, ii) leur caractère constitutif ou inductible et iii) la régulation post-transcriptionnelle de leurs activités. En effet, les isoformes neuronale et endothéliale sont toutes les deux exprimées de manière constitutive dans le système cardiovasculaire et leur activité est fortement régulée au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel. L’activité de ces NOS est aussi fortement dépendante de la concentration intracellulaire en Ca2+. La iNOS est quant à elle exprimée de manière induite par différents stimuli tels que les stress oxydant et inflammatoire. Son activité est indépendante du Ca2+, et contrairement aux isoformes constitutives, son activité est essentiellement déterminée par son niveau d’expression (Umar and van der Laarse, 2010). Alors que les NOS constitutives induisent une synthèse de NO de l’ordre du nanomolaire, la iNOS génère une production de NO 10 à 100 fois supérieure, avec des concentrations cellulaires pouvant atteindre le micromolaire.

Le NO peut également être synthétisé à partir de stocks de métabolites du NO. Ces stocks sont présents sous deux grandes formes : les nitrites (NO2-) et les nitrosothiols (SNO). Les nitrites myocardiques peuvent être réduits en NO grâce à une famille d’enzymes comprenant les nitrites réductases et les myoglobines (Rassaf Tienush et al., 2007). Ces enzymes ont la capacité d’être activées en condition d’acidose et de faible pression en O2 (Totzeck et al., 2015; Zweier et al., 1999). De telles conditions peuvent être retrouvées lors d’une ischémie myocardique (Duranski et al., 2005) permettant ainsi de maintenir la biodisponibilité en NO dans ces conditions.

D’autre part, le S-nitrosoglutathion (GSNO), S-nitrosothiol endogène formé par la réaction entre le NO et la forme réduite du glutathion (GSH), peut être à l’origine d’une transnitrosylation au cours duquel le groupement NO pourra se fixer sur les cystéines oxydées des protéines formant ainsi des RSNO. Les mécanismes de dénitrosylation protéique impliquent des réactions enzymatiques (dénitrosylases) et non enzymatiques (ascorbate) (Paige et al., 2008). La dénitrosylation implique des dénitrosylases telles que la S-nitrosoglutathione réductase (GSNOR), enzyme capable de dénitrosyler les protéines en reformant du GSNO à partir du GSH et des thiorédoxines (Trxs). En résumé, comme le montre la Figue 16, l’homéostasie cellulaire du NO est régulée par deux mécanismes principaux : la transnitrosylation et la dénitrosylation à travers des réactions enzymatiques et non enzymatiques. Les réactions enzymatiques sont médiées par les S-nitrosylases et les S-dénitrosylases qui contrôlent les niveaux cellulaires de SNO tandis que les reactions non enzymatiques sont majoritairement médiées par l’ascorbate (Xiaomeng and Hongyu, 2020) (Figure 16).

Figure 15 : Schématisation des mécanismes moléculaires impliqués dans le stockage des métabolites du NO.

Considérant le rôle majeur du NO et de la eNOS dans les voies de cardioprotection, la suite de la revue sera axée principalement sur cette isoforme, sur son interaction avec les mitochondries et sur son rôle dans la cardioprotection.

Synthèse du NO par la eNOS

La eNOS est une enzyme active sous forme d’homodimère et dont chaque monomère est constitué d’un domaine oxygénase N-terminal comprenant les sites de fixation du substrat : la L-arginine, le cofacteur essentiel à l’état dimérique, la tétrahydrobioptérine (BH4), ainsi qu’un groupement hémique. Elle est également constituée d’un domaine réductase C-terminal portant les sites de fixation du nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH), de la flavine adénine dinucléotide (FAD) et de la flavine mononucléotide (FMN), ainsi qu’un site de fixation du complexe Ca2+/calmoduline (CaM) essentiel à son activation par le Ca2+. La eNOS est une oxydoréductase, son activité catalytique menant à la synthèse de NO requiert un transfert d’électrons de la NADPH au FAD puis au FMN du domaine réductase d’un monomère, et se termine au groupement hémique du domaine oxygénase de l’autre monomère. Ceci permet la conversion de l’hème ferrique (Fe3+) en son état ferreux (Fe2+) et autorise ainsi la fixation de l’O2 sur la eNOS. En effet, l’hème oxydé est alors capable de fixer l’O2 et la L-arginine, conduisant à la synthèse de NO et de L-citrulline par oxydation de la L-arginine. (Figure 16).

La présence de BH4 est essentielle à l’état de couplage fonctionnel de la protéine et donc à la formation du NO. Il participe également à la fixation du substrat, la L-arginine, ainsi qu’au transfert d’électrons. En absence de ce cofacteur, la L-arginine ne peut pas se fixer sur son site au niveau de la protéine, et l’accepteur terminal d’électrons devient le dioxygène, formant ainsi de l’O2^●- au détriment du NO, et ainsi du peroxynitrite (ONOO-).

Figure 16 : Synthèse du NO par la eNOS.

Régulation de son activité (transcriptionnelle et post transcriptionnelle)

L’activité de la eNOS est fortement régulée au niveau post-transcriptionnel et va être dépendante de son interaction avec de nombreuses protéines dont principalement le complexe Ca2+/CaM ; associé aux cavéolines, la Hsp90 (Heat shock protein 90) (Fleming and Busse, 2003) et à Akt. Cette régulation transcriptionnelle implique également de nombreuses modifications post-traductionnelles connues comme régulant la localisation subcellulaire et l’activité de l’enzyme. On retrouve parmi elles la S-nitrosylation, l’acétylation, la glycosylation, la glutathionylation et la (De)phosphorylation (Heiss and Dirsch, 2014). Dans ces travaux de thèse, nous nous intéresserons principalement à la phosphorylation de la eNOS, bien décrite pour son rôle clé dans la régulation de l’activité de l’enzyme.

A l’état basal, la eNOS est ancrée et maintenue dans un état inactif au niveau de la membrane plasmique via les cavéolines (CaV) (isoformes 1 et 3, respectivement endothéliale et cardiomyocytaire) (Feron et Balligand, 2006) qui sont des protéines de structure de la membrane plasmique, responsables de la formation et de la stabilisation des cavéoles (Feron and Balligand, 2006; Feron et

Figure 17 : Représentation des différents sites de phosphorylation de la eNOS et leur rôle dans l’activité de la protéine (Adaptée de Schulz et al., 2009).

al., 1998). Cette eNOS est maintenue au niveau des cavéoles via différents sites de myristoylation et palmytoylation présents au niveau du domaine oxygénase de l’enzyme (extrémité N-terminale) (Liu et al., 1996). L’activation de la eNOS en réponse à la stimulation d’agonistes (acétylcholine, la bradykinine, le VEGF ou les agonistes des récepteurs β3-adrenergiques), ou encore en réponse à un stress mécanique (forces de cisaillement ou shear stress) conduit à l’augmentation intracellulaire de Ca2+ aboutissant à la formation du complexe Ca2+/CaM qui rompt l’interaction inhibitrice CaV/eNOS. En effet, le Ca2+ en se fixant sur la CaM provoque le déplacement de la liaison inhibitrice entre la eNOS et la cavéoline, rendant ainsi la eNOS fonctionnelle. Cette dissociation primordiale à l’activation de la eNOS favorise le recrutement de Hsp90 (protéine chaperonne du cytosol) et d’Akt, qui d’une part à travers la formation d’un complexe protéique favorise l’association de la CaM avec la eNOS et d’autre part participe à la régulation de l’enzyme par phosphorylation (Figure 17), et notamment par phosphorylation du résidu Serine 1177 (Ser 117), principal site activateur de l’enzyme. Cette phosphorylation est associée en parallèle à une déphosphorylation du résidu Thréonine (Thr 495), principal site inhibiteur de la eNOS (Figure 17). Les principaux sites d’activation et inhibition de l’enzyme sont présentés dans la Figure 17. L’activation de la eNOS est à l’origine d’une translocation de celle-ci vers le cytosol. La localisation subcellulaire de l’enzyme est ensuite régulée par des complexes protéiques appelés NOSIP (NO Synthase Interacting Protein) et NOSTRIN (NO Synthase Traffic Inducer), qui favorisent la translocation cytosolique de la eNOS et son adressage aux différents organites intracellulaires (appareil de Golgi, mitochondrie).