Analyses biochimiques

Afin d’apporter un rationnel moléculaire aux modifications des paramètres physiologiques observées dans les différentes études, des analyses biochimiques des protéines impliquées dans les voies étudiées ont été réalisées. Les différentes techniques biochimiques présentées ont été faites sur tissu entier de VG, sur cardiomyocytes isolés et mitochondries isolées pour les deux études.

1. Extraction des protéines et dosage de la concentration protéique

1.1. Sur homogénat de cœur total (VG)

Pour toutes les mesures réalisées sur cœur entier, les VG congelés au terme des différentes études étaient homogénéisés à l’aide d’un Ultra Turrax (IKA T10) dans du tampon d’extraction SB (50 mM de Tris-HCl pH : 5,7, 10% de glycérol, 1% de Sodium Dodécyl Sulfate) avec des inhibiteurs de phosphatases NaOV (Fisher Scientific) et de protéases (Sigma Adrich), ou dans du tampon HENS (Thermo Fisher) lors des analyses biochimiques concernant la S-nitrosylation des protéines. Les échantillons étaient ensuite centrifugés à 17 000 g pendant 20 minutes à 4 °C. Le surnageant était ensuite récupéré et congelé à -80 °C. La concentration totale en protéines de chaque échantillon était évaluée via la méthode de dosage BCA (Bincinchonic acid, Pierce® BCA Protein Assay Kit ; Thermo Scientific).

1.2. Sur mitochondries isolées

Les homogénats des fractions enrichies en mitochondries ainsi que les fractions cytosoliques ont été obtenus comme décrit dans la partie II/4/4.1 du manuscrit. Afin de normaliser la quantité de mitochondries d’une expérimentation à l’autre mais également afin étudier l’expression des protéines mitochondriales, par Western Blot, les protéines ont été dosées avec un kit de dosage BCA (Bicinchonidic acid, Pierce® BCA Protein Assay Kit ; Thermo Scientific).

2. Western Blot

Après dosage, les échantillons ont été dénaturés via l’ajout de β-mercapto-éthanol (5%) et incubés 5 minutes à 95 °C. Ensuite, chaque échantillon était déposé et séparé par électrophorèse durant 1 heure dans un gel de dodécyl sulfate de sodium polyacrylamide (SDS-PAGE), avec une solution d’acrylamide (de 7 à 12% selon le poids moléculaire de la protéine étudiée). Les proteines étaient ensuite transférées électriquement pendant environ 1 heure et 30 minutes sur une membrane de PVDF (polyvinylydène difluoride), préalablement activée dans une solution d’éthanol, à l’aide d’un appareil transblot (Bio-Rad transfert apparatus, Bio-rad Laboratories). Les membranes étaient ensuite incubées dans une solution de blocage, composée de TBS-T (Tris-Buffered Saline, 0,05% de Tween 20, pH : 7,5) et de lait ou de BSA selon la protéine étudiée, afin de saturer les sites non spécifiques. Finalement les membranes étaient incubées avec un anticorps primaire, reconnaissant la protéine d’intérêt, 12 heures sous agitation à 4 °C. Selon la protéine étudiée, les membranes étaient ensuite incubées sous agitation lente en présence de l’anticorps primaire correspondant : VDAC (anti-mouse VDAC, abcam), Cx43 (anti-mouse Cx43, Zymed Laboratories), GAPDH (anti-rabbit GAPDH, Santa Cruz Biotechnology), eNOS (anti-mouse eNOS, BD Biosciences), nNOS (anti-mouse nNOS, BD Transduction Laboratories), P-eNOS (anti-mouse P-eNOS Ser1177, BD Biosciences). Suite à l’incubation avec l’anticorps primaire, les membranes étaient rincées par 3 lavages de 5 minutes avec du TBS-T, puis incubées avec un anticorps secondaire spécifique à l’anticorps utilisé, pendant 1 heure à température ambiante. A nouveau, les membranes étaient rincées 4 fois au TBS-T, puis immergées dans une solution d’ECL (Enhanced ChemiLuminescence, ThermoScientific), contenant du luminol, substrat de l’enzyme HorseRadish Peroxydase (HRP) conjuguée à l’anticorps secondaire. Cette peroxydase catalyse la transformation du substrat et permet ainsi l’émission d’un signal lumineux ce qui permet la révélation de la protéine d’intérêt sur un film photographique. Les résultats étaient ensuite analysés grâce au logiciel Image J (National Institute of Healt, USA).

3. Mesure du s-nitrosoproteome des mitochondries cardiaques

Dans l’ETUDE n°2, la S-nitrosylation des protéines mitochondriales cardiaques a été évaluée de deux manières différentes : 1) Par Western Bot en utilisant la méthode du « TMT switch assay » (Pierce S-nitrosylation Western Blot kit, Thermo Fisher Scientific) et 2) par chromatographie en phase liquide

couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) réalisée en collaboration avec le Laboratoire Innovations technologiques pour la Détection et le Diagnostic (SPI/LI2D, Palteforme ProGénoMix, CEA Marcoule). Ces analyses de s-nitrosoprotéomique ont été réalisées sous la direction de Jean Armengaud (CEA) et Béatrice Alpha-Bazin (CEA).

3.1. Mesure de la s-nitrosylation par Western Blot

La S-nitrosylation des protéines cardiaques a été évaluée en utilisant la méthode du « TMT switch assay » (PierceTM S-nitrosylation WesternBlot kit, ThermoFisher Scientific). La méthode du « TMT switch assay » consiste à modifier les cystéines nitrosylées afin de les rendre détectable dans notre homogénat. Pour cela, les groupements thiols non modifiés des cystéines étaient bloqués via l’ajout de methanéthiosulfonate de méthyle (MMTS) (Figure 42-I) puis l’ajout de sodium L-Ascorbate (1 mM) a permis de réduire les cystéines déjà nitrosylées (Figure 42-II). Finalement, l’iodoTMT se fixait ensuite de manière irréversible sur ces résidus dénitrosylés (Figure 42-III). On parle d’étiquetage des cystéines nitrosylées. Les protéines étaient ensuite séparées par électrophorèse dans un gel de polyacrylamide et transférées sur une membrane PVDF. Après un blocage de 1 heure avec du lait 5 %, les membranes étaient ensuite incubées en présence d’un anticorps primaire anti-TMT (mouse, 1/5000, Thermo Fisher Scientific) toute la nuit, sous agitation, à 4 °C. L’anticorps secondaire (anti-mouse, 1/20 000, BD Biosciences) était incubé 1 heure à température ambiante. Finalement, les protéines étaient visualisées grâce à la chemiluminescence par une immersion dans une solution d’ECL, suivit d’une révélation sur film photographique. L’intensité des bandes est représentative du niveau de S-nitrosylation protéique et est également mesurée grâce au logiciel Image J®.

Figure 42 : Protocole expérimental de la méthode « TMT switch assay » permettant la détection des résidus protéiques S-nitrosylés.

3.2. Mesure du S-nitroproteome par LC-MS/MS

Toute la préparation des échantillons, c’est-à-dire isolement des différentes fractions subcellulaires (fraction enrichie en SSM et homogénat total) et étiquetage des cystéines nitrolyslées a été réalisée au LaPEC, tandis que l’analyse du s-nitrosoproteome a été réalisé au Laboratoire Innovations technologiques pour la Détection et le Diagnostic (SPI/LI2D, Palteforme ProGénoMix, CEA Marcoule).

3.2.1. Préparation des échantillons et etiquettage des cystéines nitrosylées.

Les SSM cardiaques intactes (1 mg/mL) ont été obtenues de manière identique à celles exposées dans la partie III/3.1. Après extraction des protéines mitochondriales (fraction enrichie en SSM), le culot était remis en suspension dans du tampon HENS contenant (en nmol. L-1) : HEPES-NaOH (250), EDTA (1) et Neocuproine (0,1) avec 2,5% de SDS et un inhibiteur de protéase sans EDTA. Afin de libérer les protéines mitochondriales, les SSM ont été soumises à 3 cycles de congélation/décongélation dans de l’azote liquide. Les fragments lipidiques non dissous ont été éliminés par centrifugation (10 000 g durant 10 minutes, 4 °C). L’étiquetage des cystéines nitrosylées a été réalisé à l’aide du kit de marquage et d’enrichissement du Tandem Mass Tag réactif à la cystéine (cysTMT, ThermoFisher Scientific). La S-nitrosylation étant une modification post-traductionnelle très sensible à la lumière, toutes les procédures précédemment décrites ont été réalisées dans l’obscurité. (Figure 42 pour représentation

du protocole d’étiquetage).

Les homogénats de VG (1000 µg) de cœur de rats Sed et Ex-Tr ont été extraits et resupendus dans du tampon HENS contenant (en nmol.L-1) = de l’HEPES-NaOH (250), de l’EDTA (1) et du Neocuproine (0,1) avec 2,5% de SDS et un inhibiteur de protéases sans EDTA. Afin de bloquer les cystéines non modifiées (c’est-à-dire libres), les échantillons sont incubés avec du MMTS (20 mM) pendant 30 minutes à température ambiante. Afin d’éliminer le MMTS, les protéines étaient précipitées en utilisant de l’acétone pré-refroidie à -20 °C pendant 1 heure. Après élimination du MMTS, les échantillons étaient remis en suspension dans du tampon HENS et incubés avec de l’ascorbate (1 mM) et de l’iodo-TMT, pendant 1 heure à 37 °C, à l’obscurité. La réaction est stoppée via l’ajout de DTT (20 mM, 15 minutes à 37 °C, dans l’obscurité). L’excès de iodo-TMT était éliminé par précipitation à l’acétone et les protéines étaient lavées avec de l’acétonitrile, suivi de deux lavages

mg.mL-1 et soumis à une digestion à la trypsine à 50 °C durant 1 heure. L’ajout d’acide trifluoroacétique permettait une acidification du milieu (concentration finale 0,4%). Après l’ajout de trypsine (rapport enzyme/substrat : 1:40), la lyse des protéines était effectuée à 50°C durant 1 heure. Les peptides résultants ont été dessalés à l’aide de cartouches d’extraction en phase solide C18 (ThermoScientific) et lyophylisés à l’aide d’un concentrateur sous vide (SpeedVac, Thermo Fisher). Les peptides étaient ensuite dilués dans une solution saline (TBS) et incubés avec une résine anti-TMT durant 2 heures, à température ambiante. Le surnageant était ensuite éliminé et la résine était rincée 5 fois avec du TBS et 3 fois avec de l’eau ultra pure. Les peptides marqués au CysTMT étaient ensuite élués à l’aide de 4 colonnes de tampon d’élution TMT (Thermo Scientific). Toutes les fractions étaient ensuite combinées et lyophilisées dans un concentrateur sous vide et remise en suspension 0,1% d’acide formique.

3.2.2. Analyse par chromatographie en phase liquide couplée à la spéctrométrie de masse en tandem sur Q Exactive HF (LC-MS/MS)

La spectrométrie de masse en tandem par chromatographie en phase liquide (LC-MS/MS) a été réalisée au sein de la Palteforme ProGénoMix, CEA Marcoule par Jean-charles Gaillard. La LC-MS/MS a été réalisée l’aide d’un système nano-LC Ultimate 3000 couplé à un spectromètre de masse Q-Exactive HF (Thermo Fisher Scientific), fonctionnant comme décrit précédemment par Klein et al., en 2016 (Klein et al., 2016). Pour cela, les peptides étaient d’abord chargés sur une pré-colonne PepMAp 100 C18 en phase inversée (5 µm, 100 A, 300 µm, Thermo Fisher), puis séparés sur une colonne nanoLC PepMap 100 C18 à phase inversée nanométrique (3 µm, 100 A, ThermoFisher), en utilisant un gradient de 2 heures de la phase mobile A (0,1% HCOOH/100% H2O) et de la phase B (0,1% HCOOH/ 80% CH3CN/ 20% H2O) à un débit de 200 mL.min-1. Le spectromètre (Q réactive HF) a été utilisé dans un mode Top20, dépendant des données (balayage MS1 haute résolution (60 000) pour les ions précurseurs, suivit de balayages MS2 basé sur les 20 ions précurseurs des plus abondants en 10 secondes), avec une plage de balayage d’acquisition MS de 350 à 1800 m/z. Les ions secondaires ont été isolés à une limite de 2,0 m/z.

3.2.3. Exploration des données MS

Daemon (version 2.6.1 Matrix Science), en utilisant le filtre d’importation des données « extract_msn.exe » (Thermo Fisher Scientific) du package Xcalibur FT (version 2.0.7 ; Thermo Fisher Scientific). Les options de filtre d’importation des données appliquées sont 400 pour la masse minimale, 5000 pour la masse maximale, 0 pour la tolérance de regroupement, 0 pour les analyses intermédiaires et 1000 pour le seuil (en accord avec les recommandations de (Christie-Oleza et al., 2012)). Les spectres MS/MS ont été attribués en utilisant les critères de recherche suivants : base de données : Rattus_norvegicus_sprague-dawlet_NCBInr_2019-01-11. Tous les peptides identifiés avec un p inférieur à 0,05 et toutes les protéines identifiées avec au moins deux séquences peptidiques distinctes ont été analysés à l’aide du logiciel IRMa 1.31.1c (Dupierris et al., 2009). Le nombre de spectres MS/MS attribués par protéine a été compté pour toutes les protéines sélectionnées. La comparaison de l’abondance des protéines entre les différents groupes expérimentaux a été réalisée en utilisant le test T-fold (Carvalho et al., 2012) permettant une classification statistique : bleu pour un fold change ≥1,5 et une valeur de p≤0,05, orange pour une p value ≤0,05 et un fold change ≥1,5, vert pour un fold change ≥1,5, et une p value ≥0,05 et rouge pour un fold change ≤0,05 et une p value ≥0,05. Enfin, une analyse statistique spécifique de type PLS-DA et sPLS-DA a été réalisée en utilisant le package mixOmics pour R.