Synthèse de la pyrrothine par voie semi-biologique

II.4.1. Production microbiologique des dithiolopyrrolones

Des cultures de Sa. algeriensis (14,2 L) sont réalisées en Erlenmeyers de 500 mL (cf. II.3.2, p. 61) sur milieu SS supplémenté en acide humique à 1 g L-1 _{pendant 96 h. La biomasse}

est éliminée par centrifugation 15 min à 5000 g. Le surnageant de culture (12,9 L) est récupéré pour l’extraction des dithiolopyrrolones.

II.4.2. Extraction des dithiolopyrrolones

Le surnageant de culture est extrait trois fois au dichlorométhane (1:0,3 v/v). Les traces d’eau sont ensuite éliminées de la phase organique par ajout de sulfate de sodium anhydre puis le sel est séparé de la phase organique par filtration sur un filtre de nylon (φ 47 mm, seuil de 0,2 µm). La phase organique anhydre est enfin évaporée sous pression réduite dans un rotavapor, à une température maintenue inférieure à 40 °C. L’extrait est conservé à - 24 °C jusqu’à l’hydrolyse.

II.4.3. Hydrolyse acide

Une hydrolyse acide ménagée est réalisée pour obtenir la pyrrothine à partir des dithiolopyrrolones comme breveté par Pfizer and co (1956) avec quelques modifications. L’hydrolyse est réalisée dans un système bi-phasique HCl/dioxane 1:5 v/v à reflux pendant 30 ou 60 minutes à une température comprise entre 50 et 100 °C. 100 mg d’extrait sont hydrolysés dans 6 mL de milieu réactionnel. Ensuite, le mélange réactionnel est refroidi d’abord à température ambiante puis dans la glace. Il est enfin évaporé à sec dans un rotavapor à une température maintenue inférieure à 60 °C. L’extrait sec est solubilisé dans le méthanol dans les proportions suivantes : 3,5 mg d’extrait sec par mL de méthanol. 5 mL de la solution méthanolique sont filtrés sur un filtre en PVDF (0,2 µm) pour analyses. L’hydrolysat, filtré et non filtré est conservé à -24 °C.

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II.4.4. Mise en évidence de la pyrrothine

II.4.4.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)

L’hydrolysat a d’abord été analysé par CCM.

Les échantillons sont déposés sur des plaques CCM en aluminium, d’épaisseur 0,2 mm en silice F254. L’élution est réalisée avec un mélange Chloroforme/Méthanol 9:1 v/v (solvants grade HPLC). Les échantillons suivants sont déposés : 40 µL de standard de thiolutine à 60 mg L-1 dans H20/CH3CN 50:50 v/v (S) et 20 µL d’hydrolysat (H). Les dépôts

sont réalisés en double (dépôts A et B).

Les dépôts A (demi-plaque A) sont observés sous UV à 254 nm. Dans ces conditions la silice fluoresce tandis que les composés apparaissent sous forme de tâches sombres.

Les dépôts B (demi-plaque B) sont révélés à la ninhydrine. La plaque est pulvérisée de ninhydrine à 0,5 % dans le butanol puis séchée au sèche-cheveux. La réaction de la ninhydrine avec les fonctions amines libres est activée par chauffage de la plaque à environ 100 °C pendant 3 minutes sur une plaque chauffante. Les tâches correspondant à un composé présentant une fonction amine libre se colorent en violet (ils sont ninhydrine +). La thiolutine ne présente pas d’amine libre et est donc ninhydrine -. La pyrrothine présente une amine libre et est donc ninhydrine +. Seules les tâches colorées ou ninhydrine + apparaissent sur la demi- plaque B.

II.4.4.2. Analyse HPLC : méthode « détection pyrrothine »

La présence de pyrrothine dans l’hydrolysat est également vérifiée par HPLC.

La phase mobile est composée d’un mélange d’eau ultrapure et d’acétonitrile (grade HPLC). Les analyses sont réalisées à un débit de 0,8 mL min-1 _{et la colonne est thermostatée à}

30 °C. Les dithiolopyrrolones sont détectées et quantifiées en UV à 390 nm. 30 µL d’hydrolysat, préparés comme décrit paragraphe II.4.3 p. 65., sont injectés. La méthode utilisée est décrite dans le Tableau II-2. L’appareillage utilisé est présenté dans le paragraphe II.1, p. 58.

Dans ces conditions d’analyse les temps de rétention de la pyrrothine et de la thiolutine sont de 8,3 min et 9,85 min respectivement. Les spectres UV obtenus à Tr = 8,3 min et 9,85 min sont en accord avec ceux décrits dans la littérature pour la pyrrothine (Pfizer and co 1956) et la thiolutine (Lamari et al. 2002a) respectivement.

67 Tableau II-2 Méthode HPLC « Détection pyrrothine » utilisée pour la détection de la pyrrothine dans l’hydrolysat.

Temps (min) solvant A: CH3CN en % solvant B: H20 en % Pré-run -7 20 80 0 20 80 Run 0 20 80 30 50 50 35 100 0 Post-run 35 100 0 37 0 100

II.4.5. Purification par chromatographie sur couche épaisse (CCE)

Pour la préparation de 5 plaques de 0,5 mm d’épaisseur, 60 g de silice sont mélangés avec 120 mL d’eau distillée. La silice est étalée à l’aide de l’étaleur sur des plaques de verre (20 x 20 cm). Une fois sèches, les plaques sont activées 1 h à 100 °C.

400 µL d’hydrolysat (3,5 mg d’extrait mL-1 _{de méthanol) sont déposés en trait à 2.5}

cm du bord à l’aide d’une pipette de 10 µL sur 17 cm de large. La migration est effectuée dans 50 mL de solvant de migration, chloroforme/méthanol 9:1 v/v. Le front d’élution migre sur 16,5 cm.

Les plaques sont grattées au niveau de la première (Rf variant de 0,5 à 0,6, H1) et de la 2ème bande jaune (Rf variant de 0,67 à 0,77, H2). La silice récupérée est mise à désorber dans 40 mL de méthanol, sous agitation (240 RPM), dans des erlenmeyers de 250 mL pendant 2 h 30. La silice est éliminée par filtration sur papier Whatman qualitatif puis sur filtre seringue PVDF (seuil de 0,2 µm). Le filtrat est évaporé à sec sous pression réduite au rotavapor à une température maintenue inférieure à 40 °C. Ensuite, l’extrait sec est solubilisé dans 400 µL de méthanol.

Pour évaluer la purification, l’extrait concentré est alors filtré sur un filtre seringue 0,2 µm, déposé dans un vial puis analysé par HPLC suivant la méthode « Détection pyrrothine » présentée en II.4.4.2, p. 66.

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II.4.6. Purification par HPLC semi-analytique

II.4.6.1. Réalisation

L’étape de purification de la pyrrothine dans l’hydrolysat par chromatographie en phase inverse est effectuée sur une HPLC semi-analytique (appareillage décrit dans le paragraphe II.1, p. 58). La phase mobile est composée d’un mélange eau ultrapure/acétonitrile (grade HPLC). La chromatographie est réalisée à un débit de 2 mL min-1_{. Le suivi}

chromatographique est réalisé par détection UV à 220 nm. Chaque pic détecté en UV est collécté dans un tube à hémolyse en verre. 150 µL d’hydrolysat sont injectés. La méthode utilisée est décrite dans le Tableau II-3.

Tableau II-3 Méthode HPLC « Purification pyrrothine » utilisée pour la purification de la pyrrothine par HPLC semi-analytique.

Temps solvant A: CH3CN en % solvant B: H20 en % 0 20 80 45 35 65 50 50 50 51 100 0 56 100 0 57 20 0

II.4.6.1. Evaluation de la purification par HPLC analytique

Les fractions récoltées sont séchées par évaporation sous un jet d’air puis resupendues dans 150 µL de méthanol (grade HPLC) et numérotées suivant leur ordre de récupération (temps de rétention de F1 < temps de rétention de F2). Elles sont ensuite analysées par HPLC analytique suivant la méthode « Détection pyrrothine » présentée en II.4.4.2, p. 66. Le volume d’injection varie de 30 à 60 µL.

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