CHAPITRE II Matériel et méthodes
II.5. Synthèse de la pyrrothine par voie chimique
Les solvants (CH2Cl2, Et3N, EtOH, heptane, THF, cyclohexane, AcOEt, MeOH, Et2O
et TFA) sont séchés sur tamis 4 Å. Les autres produits chimiques, obtenus de source commerciale, sont utilisés sans purification. Les analyses RMN 1H sont réalisées au
Laboratoire de Chimie de Coordination (Toulouse, France) sur un spectromètre Bruker DPX 300. Les constantes de couplage sont données en hertz et les déplacements chimiques en ppm. Les spectres sont présentés en Annexe 3 et 4.
Avant de réaliser la synthèse de la pyrrothine, la synthèse chimique de l’holothine a d’abord été réalisée suivant le protocole de Hjelmgaard et al. (2007). Les différentes étapes sont décrites Figure II-1.
N S S O NH 3+, Cl- H (a) SPMB SPMB O (b), (c) N O HO BMPS PMB SPMB (d) N O H2N BMPS PMB SPMB (e) NH S S TFAHN O (f) 1 2 4 5 6 Cl Cl O NH3+, Cl- 3
Figure II-1 Synthèse de l’holothine 6 – Etapes (a) méthoxyde de sodium (NaOMe, 2eq.), p- méthoxybenzylthiol (PMBS, 2eq.), éthanol, reflux, 100%, (b) p-méthoxybenzylamine (PMBNH2, 1eq.),
Et3N, THF, TiCl4, heptane, (c) chlorure d’oxalyle (2eq.), Et3N, THF, 41,57 %, (d) Acétate d’ammonium,
150 °C, 58,2 %, (e) m-crésol (10 eq.), TFA, reflux, 41,09 %, (f) HCl(aq), MeOH, reflux, 53,7%.
Quelques modifications ont été apportées au protocole de référence :
- A l’issu des réactions b) et c) le produit 3 n’est pas purifié par chromatographie flash mais lavé à l’acétate d’éthyle puis filtré. Le filtrat est évaporé à sec sous pression réduite puis est de nouveau lavé par de l’acétate d’éthyle et filtré. Les deux précipités obtenus après filtration constituent le produit (3). Le rendement de l’étape est alors de 41,6 %. Le spectre RMN 1H obtenu correspond à celui décrit dans la publication de référence. Il
70 - L’extrait sec obtenu après la réaction d) n’est pas purifié par chromatographie flash mais le produit (4) précipite lors d’un lavage à l’Et2O de l’extrait sec. Le rendement de l’étape
est de 58,2 %. Le spectre RMN 1H obtenu correspond à celui décrit dans la publication de référence. Il indique qu’il s’agit d’un mélange des deux isomères (iso A – iso B, 80:20).
- Le produit (5) est purifié sur colonne de gel de silice avec comme éluant un mélange cyclohexane/AcOEt 1:1 v:v.
- Le produit (6), l’holothine, est récupérée par filtration du milieu réactionnel (f) après refroidissement à température ambiante. Le rendement de l’étape est de 53,7 %. La RMN
1H effectuée sur le précipité récupéré correspond bien à la structure de l’holothine. δ H
(300 MHz, DMSO-d6) : 10,85 (1H, s, NH-C=0 cyclique), 7,17 (1H, s, C=CH), 3-4,6 (1H,
s large, NH3+). Le DMSO est ajouté extemporanément au produit pour l’analyse RMN.
La synthèse de l’holothine a été réalisée avec un rendement global de 5,03 %.
La synthèse chimique de la pyrrothine a ensuite été réalisée suivant le même protocole de Hjelmgaard et al. (2007) avec quelques adaptations (Figure II-2).
6 SPMB SPMB O N CH3 O HO PMBS PMBS Cl Cl O (a) (b), (c) (e) (f) N CH3 O H2N PMBS PMBS (d) N O S S HN H O F3C CH3 N O S S NH3+,Cl- CH3 1 2 3 4 5
Figure II-2 Synthèse de la pyrrothine 6 – Etapes (a) méthoxyde de sodium (NaOMe, 2eq.), p- méthoxybenzylthiol (PMBS, 2eq.), éthanol, reflux, 100%, (b) méthylamine (MeNH2), Et3N, THF, TiCl4,
heptane, (c) chlorure d’oxalyle (2eq.), Et3N, THF, 31,4%, (d) Acétate d’ammonium, éthanol, reflux, 53,6
71 Cette fois, le groupement méthyle de l’azote cyclique est introduit lors de l’étape (b) en remplaçant la p-méthoxybenzylamine par de la méthylamine (Li et al. 2007). Les différentes étapes de la synthèse sont présentées sur la Figure II-2 et détaillées ci-dessous.
II.5.1. Réaction (a): formation de la 1,3-bis-(4-méthoxy-benzylsulfanyl)-propan- 2-one (2).
Dans un erlenmeyer rodé, on introduit 3,38 g (62,6 mmoles, 2 éq.) de NaOMe dissous dans 110 mL d’éthanol, et 8,80 mL (63,2 mmoles) de p-méthoxybenzylthiol. Le mélange est agité à température ambiante sous azote pendant 10 minutes. 3,86 g (30,7 mmoles) de 1,3- dichloroacétone sont alors ajoutés et le mélange est porté à reflux pendant 2 h. Après refroidissement à température ambiante, le mélange réactionnel est évaporé à sec sous pression réduite. Le produit obtenu est repris par 50 mL d’eau et 50 mL de CH2Cl2. Après
décantation, la phase organique est récupérée. La phase aqueuse est extraite avec deux fois 50 mL de CH2Cl2. Les trois phases organiques récupérées sont rassemblées, séchées sur du
Na2SO4 puis évaporées à sec sous pression réduite. Le produit 2 obtenu sous forme d’un
solide blanc pur (11,14 g, 30,71 mmoles, 100 %) est utilisé pour l’étape suivante sans étape de purification supplémentaire. En effet, la RMN 1H est en accord avec la structure du produit 2 :
δH (300 MHz, CDCl3) : 7,36 (4H, d, J= 8,7), 6,97 (4H, d, J= 8,7), 3,93 (6H, s, O-CH3),
3,78 (4H, s, SCH2), 3,38 (4H, s, CH2).
Rf (cyclohexane/AcOEt 1:1) = 0,56 F °C = 74 °C
II.5.2. Réaction (b) et (c): formation de la 3-hydroxy-4-(4-
méthoxybenzylsulfanyl)-5-[(4- méthoxybenzylsulfanyl)méthylidène)-1- méthyl-1H-pyrrol-2(5H)-one (3, iso A et iso B).
Une solution de 2 (11,42 g, 31,5 mmoles), de méthylamine (25 mL, 49,68 mmoles) (en solution à 10 % v/v dans le benzène) et d’Et3N (8,8 mL, 63,2 mmoles) est réalisée dans le
THF (315 mL) dans un bicol placé dans la glace et sous azote. Une solution de TiCl4 (2 mL,
18,24 mmoles) dans l’heptane (47 mL) y est ajoutée pendant 25 minutes à l’aide d’une ampoule à addition. Le mélangé est porté à reflux pendant 14 h puis refroidi à -10 °C et 2,7 mL (72,0 mmoles) de chlorure d’oxalyle sont ajoutés. Une solution d’éthyl amine (8,8 mL, 63,2 mmoles) dans le THF (325 mL) est ensuite ajoutée goutte à goutte pendant 30 minutes et
72 le mélange final est agité pendant 22 h. 250 mL d’Et2O sont alors ajoutés au mélange
réactionnel. Le mélange est filtré et le précipité est lavé avec 250 mL d’Et2O. Le filtrat est
lavé avec deux fois 250 mL d’eau distillée et les phases aqueuses combinées sont extraites avec 250 mL d’Et2O. Les phases organiques (3 x 250 mL d’Et2O) sont rassemblées, séchées
sur Na2SO4 puis évaporées à sec sous pression réduite. L’extrait sec ainsi obtenu est lavé deux
fois à l’éther. Ces deux lavages successifs permettent de récupérer 4,23 g (9,85 mmoles, 31,4 %) de 3 sous forme d’un précipité blanc. La RMN 1H est en accord avec la structure du produit 3. Il s’agit d’un mélange de deux isomères (iso A - iso B, 87:13).
δH (300 MHz, CDCl3) : 7,25-6,82 (8H, m), 6,27 (0,13 x 1H, s, C=CH, iso B), 5,99
(0,87 x 1H, s, C=CH, iso A), 3,93 (2H, s, SCH2), 3,86 (2H, s, SCH2), 3,83 et 3,80 (6H, 2s,
OCH3), 3,4 (3H, s, CH3), 2,07 (1H, s, OH).
Rf (cyclohexane/AcOEt 1:1) = 0,35 (iso A majoritaire)
II.5.3. Réaction (d): formation de la 3-amino-4- (4-méthoxybenzylsulfanyl)-5-[(4- méthoxybenzylsulfanyl)-méthylidène)-1-méthyl-1H-pyrrol-2(5H)-one (4, iso A et iso B).
Le mélange de 1,5 g de (3) (3,5 mmoles) et 54 g (70 mmoles) d’acétate d’ammonium dans 30 mL d’éthanol est porté à reflux sous agitation pendant 24 h. Après refroidissement, 50 mL d’eau sont ajoutés. Le mélange réactionnel est filtré et les insolubles sont repris dans 260 mL de dichlorométhane. La phase organique est directement séchée sur Na2SO4 puis évaporée
à sec sous pression réduite. Le produit brut est purifié par chromatographie flash sur colonne de gel de silice avec comme éluant le mélange cyclohexane/AcOEt 9:1 puis 8:2. La structure de 4 (m= 800 mg, n= 1,88 mmoles, 53,6 %) a été confirmée par RMN 1H. Il s’agit d’un
mélange de deux isomères (iso A- iso B, 68:32).
δH (300 MHz, CDCl3) : 7,34-6,76 (8H, m), 5,80 (0,68 x 1H, s, C=CH, iso A), 5,65
(0,32 x 1H, s, C=CH, iso B), 3,97 (0,32 x 2H, s, SCH2, iso B), 3,91 (0,68 x 2H, s, SCH2,
isoA), 3,77-3,83 (6H, 7s, S-CH2 et OCH3), 3,57 (0,32 x 2H, s, NH2, iso B), 3,41 (3H, s, CH3),
3,08 (0,68 x 2H, s, NH2, iso A).
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II.5.4. Réaction (e): Formation du 2,2,2-trifluoro-N-(4-méthyl-5-oxo-4,5-dihydro- [1,2]-dithiolo-[4,3-b]-pyrrol-6-yl)-acétamide (5).
1,5 g (3,52 mmoles) de 4 et 3,95 mL (36,36 mmoles) de m-crésol sont dissous dans 70 mL de TFA à température ambiante et sous azote. Le mélange est porté à reflux pendant 22 h puis refroidi à température ambiante et évaporé à sec sous pression réduite. Le produit est purifié sur colonne de gel de silice avec comme éluant le mélange cyclohexane/AcOEt 7:3 puis 1:1 v/v. La RMN 1H du produit isolé (420 mg, 1,49 mmoles, 42,33 %) est en accord avec
la structure du produit 5.
δH (CDCl3) : 8,3 (1H, s, NH-C=0), 6,83 (1H, s, C=CH), 3,42 (1H,s, CH3).
Rf (CHCl3/MeOH, 9:1) = 0,6
II.5.5. Réaction (f): Formation de l’hydrochlorure de la 6-amino-4-méthyl-[1,2]- dithiolo-[4,3-b]pyrrol-5-one (6): la pyrrothine
1,1 mL d’HCl concentré sont ajoutés à une solution de 230 mg de 5 (0,816 mmoles) dans 30 mL de méthanol à température ambiante sous azote. Le mélange obtenu est porté à reflux 3 h. Après refroidissement à température ambiante, le mélange est filtré. Le précipité isolé (90 mg, 0,405 mmoles, 49,63 %) de couleur brun-orangé est caractérisé par RMN 1H.
Le spectre obtenu est en accord avec la structure du produit 6.
δH (DMSO-d6) : 7,41 (1H, s, C=CH), 3,9-5,3 (1H, s large, NH3+), 3,27 (3H, s, CH3).
En raison de l’instabilité du produit dans le DMSO, celui-ci est ajouté extemporanément au produit pour l’analyse RMN.
Rf (CHCl3/MeOH, 9:1) = 0,52
Le spectre UV du pic majoritaire en HPLC, obtenu grâce à la détection UV avec un détecteur à barette de diode, est le suivant: λmax (absorbance relative) 225 (0,39), 305 (0,55), 385 (1) dans un mélange eau/méthanol 87:13 v/v.
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II.6. Préparation d’un extrait cellulaire de Saccharothrix algeriensis pour des