Suspensions cellulaires provenant de fleurs immatures

Les recherches les plus avancées sur l’établissement de suspensions cellulaires chez le bananier, qui ont d’ailleurs inspirées de nombreuses études, reviennent au travaux de Ma de l’Université de Taiwan (dans Chatelet, 1992) qui a mis au point le milieu de culture et la méthodologie pour obtenir des suspensions cellulaires à partir de fleurs mâles.

L’originalité de cette technique réside dans l’utilisation de très jeunes fleurs mâles immatures, organe très réactif et présent chez tous les génotypes ayant un bourgeon mâle persistant à part ceux du groupe Horn (Escalant et al., 1994). L’utilisation des fleurs femelles immatures a permis de rendre cette technique potentiellement généralisable à tous les types de

La culture de jeunes mains de fleurs mâles de rang 1 à 15 adjacentes de l’apex sur milieu Murashige et Skoog (1962) riche en auxine (18 µM de 2 ,4 D; 5,4 µM d’ANA et 5,7 µM d’AIA) donne un cal compact nodulaire sur lequel se développe parfois un cal blanc friable porteur de multiples proembryons avec une fréquence de 5 % chez le cultivar GN (Escalant et al., 1994). Le transfert des cals friables embryogènes en milieu liquide contenant 4,5 µM de 2,4 D permet l’établissement d’une suspension cellulaire embryogène (Escalant et al., 1994; Côte et al., 1996). La suite du protocole à savoir la maturation et la germination des embryons sur milieu solide sont obtenus respectivement sur milieu contenant 1,1 µM d’ANA, 0,2 µM de zéatine, 0,5 µM de kinétine et 0,7 µM de 2 iP et sur milieu de germination contenant 0,2 µM de BAP et 1,1 µM d’AIA. Côte et al. (1996) ont obtenu, en fonction de la taille des embryons, un taux de germination de 3 à 20 %. La régénération à partir de suspensions cellulaires peut être aussi réalisée en milieu liquide à immersion temporaire. En utilisant ce système, Gomez et al. (2000) ont obtenu un taux de germination de 27 % chez le cultivar FHIA-18 (AAAB).

Le point le plus déterminant pour l’établissement d’une suspension embryogène à partir des fleurs mâles est l’obtention des cals friables embryogènes. Grapin (1995) n’a obtenu que des cals jaunes nodulaires parfois porteurs d’embryons. Chez le cultivar GN, la mise en culture des cals non porteurs d’embryons en milieu liquide ne donne pas de suspensions cellulaires. En revanche, la mise en culture des cals jaunes porteurs d’embryons en milieu liquide donne une suspension de cellules méristèmatiques sans pouvoir de régénération.

Grapin (1995) a obtenu 0,4 % de cal friable embryogène chez le cultivar French sombre (plantain). A partir de ces cals une suspension cellulaire embyogène a été établie. Plus récemment, un taux de 10 % de cals friables embyogènes a été obtenu chez le cultivar Mas (AA) (Mahanom et al., 2003).

Bien que des suspensions cellulaires embryogènes aient été obtenues à partir des inflorescences mâles de plusieurs groupes génomiques (tableau 3) (Strosse et al., 2003), on ne saurait dire que la production de suspensions cellulaires embryogènes à partir de fleurs mâles est parfaitement maîtrisée. Cependant, plusieurs travaux ont montré l’influence du génotype, de l’explant et la saison du prélèvement du matériel végétal sur l’induction des cals friables embryogènes. En effet, l’influence du génotype est déterminant pour l’induction de cals embryogènes (Escalant et al., 1994; Grapin, 1995; Annual Report INIBAP, 1999). La fraîcheur du matériel végétal agit fortement sur le potentiel embryogène des explants. Un

diminue de moitié le potentiel embryogène des explants. D’autre part, le transport de bourgeons mâles du Costa-Rica à Montpellier pour mettre en culture les explants diminue aussi la réactivité des explants (Grapin, 1995).

Escalant et al. (1994) ont montré que la réponse embryogène des fleurs mâles dépend de la saison du prélèvement des bourgeons mâles. Au Costa Rica, les meilleures périodes de prélèvement se situent entre les mois de février et avril et de septembre à octobre.

De même, les bourgeons mâles à partir desquels les mains des fleurs mâles sont isolés ainsi que la position des ces derniers par rapport au méristème floral agissent fortement sur la capacité embryogène des explants (Escalant et al., 1994; Escalant et al., 1996; Grapin et al., 1998; Mahanom, 2003).

Comme le montre les données ci-dessus, l’initiation de suspensions embryogènes de Musa à partir des fleurs mâles pose de nombreux problèmes. Outre la longueur de la phase d’obtention des cals embryogènes qui est de trois à huit mois, la réponse embryogène des explants est généralement inférieure à 5 %. Parmi les « bons » cals, la proportion de ceux qui donnent une bonne suspension est de un sur deux à un sur cinq. De plus l’établissement d’une suspension à partir d’un cal prend environ six mois (Schoofs et al., 1999). Cependant, ces difficultés sont contrebalancées par l’importance de la suspension cellulaire une fois qu’elle est établie. En effet, la quantification de l’efficacité de régénération montre que 1 mL de volume cellulaire a permis la formation de 105 embryons avec un taux de germination de 40 % pour le cultivar French Sombre. Pour le cultivar GN, 1 mL de volume cellulaire a permis la formation de 3,5.105 embryons avec un taux de germination de 5 % (Grapin et al., 1998).

Tableau 3 : Liste des cultivars ayant donné des cals embroyogènes (CI) ou des suspensions

cellulaires embryogènes (SCE) en utilisant la méthode des fleurs immatures (d’après Strosse et al.,2003).

Cultivar Groupe

génétique CI SCE Référence

Col.49 AA X X Grapin et al., 1998

SF 265 AA X X Grapin et al., 1998

IRFA 903 AA X X Côte et al., 2000a

GN AAA X X Escalant et al., 1996, Côte et al., 1996

Gros Michel AAA X X Grapin et al., 1998

Ykm 5 AAA X Non examiné Grapin et al., 1998

French sombre AAB X X Grapin et al., 1996

Dominco AAB X X Grapin et al., 1998

Mysore AAB X Non examiné Grapin et al., 1998

Silk AAB X Non examiné Grapin et al., 1998

Curare AAB X* X Grapin et al., 2000

Curare enano AAAB X* X Grapin et al., 2000

FHIA-01 AAAB X X Grapin et al., 1998

FHIA-02 AAAB X X Grapin et al., 1998

x*: Cal obtenu à partir de fleurs femelles

CI: Cal idéal qui porte de nombreux proembryons SCE: Suspension cellulaire embryogène