3. Essai d’hybridation somatique par fusion chimique au PEG
3.2. Culture des protoplastes après traitement de fusion
3.2.2. Hétéro-fusion entre le génotype PJB et le cultivar IRFA 903
Durant les expériences visant à associer le génotype PJB avec le cultivar IRFA 903, nous avons effectué les hétéro-fusions suivantes :
-protoplastes de IRFA 903 × protoplastes de PJB issus de la suspension cellulaire obtenue à partir de fleurs mâles.
- protoplastes de IRFA 903 × protoplastes de PJB issus de la suspension cellulaire obtenue à
partir de CHP.
Dans le premier type de fusion, 32 boîtes de Pétri ont été ensemencées et dans le deuxième type 19 boîtes de Pétri ont été cultivées. Ces cultures, ont eu une évolution similaires avec la formation de cals jaunâtres à croissance très active. Ces cals couvrent toute la surface ensemencée de la couche nourrice.
Des prélèvements effectués après 2 mois de culture, à partir de cals ont été repiqués sur le milieu de régénération A0,4B0,5.Ces cultures se sont rapidement noircies.
Les cals obtenus sur la couche nourrice et gardés sans repiquage n’ont pas présenté de structure embryogène. Ils se sont noircis après 3 mois de culture (Fig. 29 B). L’observation microscopique des cals a montré qu’ils sont constitués de cellules allongées en forme de ‘‘ banane ’’ contenant de nombreuses inclusions phénoliques (Fig. 29 C).
Nos résultats issus de l’hétéro-fusion montrent que les protoplastes fusionnés suivent le même développement que celui des protoplastes non fusionnés de PJB (cf. 2.2.2.).
Fig. 29:Culture de protoplastes après fusion. A: microcals issus de l’auto-
fusion de IRFA 903. B: microcals issus de l’hétéro-fusion de PJB et IRFA
903. C: Aspect des cellules constituants les microcals issus de l’hétéro-
fusion de PJB et IRFA 903.
4. Discussion
Nos résultats montrent que le rendement en protoplastes dépend du matériel végétal utilisé. Lorsque les suspensions cellulaires sont utilisées comme source d’isolement de protoplastes le rendement est élevé. Par contre, ce rendement est faible quand les protoplastes sont issus de feuilles. Ce résultat est en accord avec les travaux réalisés chez le bananier par plusieurs chercheurs cités par Haïcour et al., (2004). Dans le cas de matériel végétal récalcitrant (arbres, monocotylédones), les suspensions cellulaires constituent le matériel idéal pour l’obtention de protoplastes (Brent et Mc Cown, 1988; Haïcour et al., 2002) ceci a été démontré chez plusieurs espèces comme le riz (Datta et al.,1992; Jain et al., 1995), le maïs (Prioli et Söndahl, 1989) le blé (Vasil et al., 1990) et l’orge (Funatsuki et al., 1992).
Le rendement en protoplastes d’origine foliaire n’a pas été amélioré ni par l’utilisation du PVP ni par l’augmentation de la concentration de la cellulase et de la pectolyase de la solution enzymatique. L’hypothèse avancée pour expliquer ces résultats négatifs, mettent en jeu la présence de latex et des substances phénoliques rencontrées dans les tissus de bananiers (Bakry, 1984 b). Ces composés pourraient réduire l’efficacité des enzymes utilisées et donc les protoplastes ne sont libérés qu’en faibles quantités (Teulière, 1990). Le PVP est employé
afin de limiter la production l’oxydation des phénols (Ochatt et Caso, 1986; Lang et Kohlenbach 1988), dans notre cas, sa présence n’a pas eu d’effet. Pour réaliser la culture de
protoplastes d’origine foliaire il faudrait mettre une grande quantité de matériel végétal en incubation.
La suspension cellulaire du cultivar IRFA 903 libère plus de protoplastes que les suspensions cellulaires de PJB. Ce résultat semble être lié à la composition de la suspension cellulaire, en effet les suspensions cellulaires de PJB que nous avons établies sont constituées essentiellement de gros nodules, par contre la suspension cellulaire du cultivar IRFA 903 est fine et composée essentiellement de cellules embryogènes expriment leur potentialités sur le milieu de régénération. Nos résultats confirment les travaux de Megia (1993) et Bui Trang (1994) qui ont montré que ce sont les suspensions cellulaires les plus fines fournissent le plus de protoplastes. Cependant, l’obtention d’une production importante de protoplastes pourrait être envisagée par la recherche d’une solution enzymatique particulière adaptée à la suspension cellulaire de PJB et/ou à un nouveau milieu de culture d’initiation de suspensions cellulaires qui favoriserait l’obtention de cellules embryogènes.
Dans nos conditions de travail, la culture des protoplastes d’origine foliaire n’a pas permis la constitution de colonies cellulaires, il semble que ces protoplastes n’ont pas de
pouvoir de division ou bien qu’ils le perdent suite à la macération enzymatique (Assani et al., 2002). En ce qui concerne, la culture des protoplastes issus des suspensions cellulaires, nous avons remarqué que seuls les protoplastes du cultivar IRFA 903 sont capables d’évoluer en embryons. Les protoplastes issus de la suspension cellulaire de PJB n’ont donné que des cals.
De plus, nous avons remarqué que les protoplastes isolés à partir de suspensions cellulaires de PJB sont de taille plus hétérogène avec un cytoplasme moins dense que ceux issus de la suspension cellulaire du cultivar IRFA 903. Il parait donc, que l’évolution des protoplastes est liée à la qualité de la suspension cellulaire utilisée et que l’hétérogénéité des suspensions cellulaires se répercute sur les potentialités morphogènes des protoplastes qui en sont issus. Nos résultats, montrent aussi que nous n’avons pas obtenu de régénération à partir d’embryons issus des protoplastes du cultivar IRFA 903. Assani et al. (2002) en utilisant le milieu de régénération A0,4B0,5 ont régénéré des plantes à partir d’embryons issus des
protoplastes de ce cultivar. L’échec de régénération dans nos essais peut être expliqué par le ‘vieillissement’ des suspensions cellulaires qui se répercute sur la capacité de régénération des protoplastes qui en sont issus.
Enfin, pour ce qui concerne la production d’hybride somatique, nos observations ont montré que le PEG permet la fusion des protoplastes. La culture des protoplastes après l’auto- fusion ou l’hétéro-fusion conduit seulement à l’obtention de cals qui noircissent après 2 à 3 mois de culture. Il parait donc, qu’après auto-fusion des protoplastes de IRFA 903, ces
derniers perdent la capacité d’évoluer en embryons sur la couche nourrice comme dans le cas des protoplastes témoin non fusionnés du cultivar IRFA 903 alors que l’hétéro-fusion montre que les protoplastes fusionnés de IRFA 903 et PJB suivent le même développement que celui des protoplastes non fusionnés de PJB. Ce résultat, semble être lié à l’utilisation du PEG qui réduit l’activité mitotique des cellules issues de la culture des protoplastes et par conséquent l’apparition des embryons (Assani et al., 2005).
CHAPITRE IV
IDENTIFICATION MOLECULAIRE DE CINQ GENOTYPES DE
BANANIER
Le polymorphisme génomique révélé par les marqueurs à ADN est, depuis quelques années, une caractéristique très utilisée pour identifier les différents génotypes et les produits de fusion après hybridation somatique (Fock, 2000; Collonnier, 2001). Les marqueurs SSR (simple sequence repeats ou microsatellites) constituent des outils très efficaces pour mettre en évidence ces polymorphisme.
Les microsatellites sont de courtes séquences nucléotidiques répétées et présentes en très grand nombre chez les Eucaryotes. Ces répétitions en tandem de petits motifs mono, di, tri ou tétranucléotidiques tels que (T) n, (AC) n, (ATT) n ou (ACCC) n (avec n compris entre quelques unités à plusieurs dizaines) apparaissent environ tous les 30 kb dans le génome nucléaire des plantes (Powell et al., 1996a; Powell et al., 1996 b; Godwin et al., 1997 ). Un microsatellite donné peut être présent à des milliers d’exemplaires dans le génome d’une espèce. Par ailleurs, outre leur distribution sur l’ensemble du génome, l’intérêt des microsatellites est leur polymorphisme élevé, conséquence des variations du nombre d’unités de répétitions. La technique de SSR–PCR ou amplification de séquence microsatellites représente un moyen très efficace pour révéler les polymorphismes des acides nucléiques chez le bananier (Grapin et al., 1998 b; Lagoda et al., 1998; Pillay et al., 2004).
L’objectif de ce travail est de mettre en évidence un polymorphisme de marqueurs moléculaires entre cinq génotypes de bananier en utilisant la technique de SSR-PCR. Ces marqueurs seront très utiles par la suite pour caractériser différents hybrides somatiques par comparaison avec les génotypes parentaux.
1. Amplification de marqueurs SSR nucléaires
Les couples d’amorces de microsatellites nucléaires utilisées Ba 25/26, Ba 87/88, Ba 93/94, Ba 101/102, et Ba 129/130 ont permis l’amplification de l’ADN chez tous les génotypes testés ce qui confirme la présence de ces microsatellites chez le bananier. Les résultats les plus nets ont été obtenus avec les 2 couples d’amorces Ba 87/88 et Ba 93/94.
Après une électrophorèse de 2 h 30 mn sur gel d’agarose, les profils correspondant au couples d’amorces Ba 87/88 mettent en évidence un polymorphisme entre le cultivar IRFA 903 ( Fig. 30 gauche, puit 6) et les 4 autres génotypes. Le couple d’amorces Ba 93/94
permet de distinguer 3 types de diagrammes: celui relatif au cultivar IRFA 903 (Fig. 30 droite, puit 6) celui de PB (Fig. 30 droite, puit 5) et celui qui commun aux 3 autres
génotypes GN, Ykm 5, et PJB (Fig. 30 droite, puits 1 à 4).
Les séquences microsatellites obtenues après amplification PCR de l’ADN des génotypes diploïdes, avec les 2 couples d’amorces ont ensuite été séparées par une électrophorèse de 5 h sur gel d’agarose. Les polymorphismes apparaissent plus nettement et permettent de distinguer chacun des 3 génotypes diploïdes avec chaque couple d’amorce (Fig. 31). Chaque profil comporte 2 bandes de microsatellites. Avec le couple d’amorces Ba 87/88, les profils présentent 2 bandes d’ADN de 250 et 275 paires de base (pb) environ pour PJB, 2 bandes de 250 et 300 pb pour PB et 2 bandes de 275 et 300 pb pour IRFA 903. Les amorces Ba 93/94 conduisent à des profils comportant 2 bandes d’ADN de 150 et 200 pb environ pour PJB, 2 bandes de 165 et 225 pb pour PB et 2 bandes de 175 et 250 pb pour IRFA 903. Des 2 couples d’amorces, c’est le couple Ba 93/94 qui donne le meilleur polymorphisme entre les 3 génotypes, permettent de caractériser chaque génotype par 2 bandes spécifiques.
Quand l’électrophorèse des produits d’amplification est réalisée sur gel de polyacrylamide, les meilleurs profils sont obtenus avec le couple d’amorces Ba 93/94
(Fig. 32). Les 5 génotypes présentent 1 bande d’ADN commune de 250 pb environ et des bandes spécifiques permettant de distinguer chacun des 3 diploïdes. Les 2 génotypes
Ykm 5 et PJB sont caractérisés par des profils identiques entre eux mais différents des 3 autres génotypes. En résumé:
- GN présente 1 bande d’ADN microsatellite spécifique de 210 pb environ, - Ykm 5 et PJB présentent 2 bandes spécifiques de 200 et 225 pb environ, - PB est caractérisé par 1 bande spécifique de 260 pb environ,
Fig. 30 : Profil moléculaire obtenu sur gel d’agarose après amplification par
PCR en présence des couples d’amorces Ba 87/88 (gauche) et Ba 93/94 (droite). 1 et 2: GN; 3: Ykm 5; 4: PJB; 5: PB; 6: IRFA 903.Fig. 31 : Profil moléculaire obtenu sur gel d’agarose après une longue durée de
migration (5h) après amplification par PCR en présence du couples d’amorces Ba 87/88 (gauche) et Ba 93/94 (droite) 1: PJB; 2: PB; 3: IRFA 903250 225 200