3 La surexpression du R -1 affecte les signaux calciques dans les cellules du Clone

a) Calcium cytosolique

Nous avons entrepris de mesurer les variations de concentrations de calcium dans le cytosol des cellules HepG2 et des cellules du Clone 9. Il s’avère que la lignée cellulaire HepG2 présente très rarement des oscillations de calcium aussi régulières que les hépatocytes. Nous n’avons donc pas pu comparer les caractéristiques des oscillations de calcium cytosolique dans les cellules HepG2 et les cellules du Clone 9. Les courbes doses réponses de l'augmentation de Ca2+ induite par l'ATP ne montrent pas de différences, suggérant que la voie de transduction dépendante de l'InsP3 n'est pas affectée par la surexpression du R1.

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Dans de précédents travaux réalisés sur des hépatocytes isolés au sein du laboratoire, il a été montré que le R1 interagissait avec le R-IP3 de type 1 mais pas avec le R-IP3 de type 2 (Abou-Lovergne, Collado-Hilly et al. 2011). Toutefois les mesures du calcium cytosolique de base montraient que cette concentration était significativement plus élevée dans les cellules du Clone 9 que dans les cellules HepG2 : 167+22 vs 110+17 p<0,05 (figure 34). L’élévation de la concentration de calcium cytosolique de base pourrait résulter d’une augmentation de l'influx de calcium externe, d’une augmentation de la sortie de calcium du RE ou d'une diminution de la capture de calcium dans le RE. Cette différence est retrouvée dans des expériences réalisées en milieu sans calcium externe. Cela suggère que l’influx de calcium externe ne participe pas à cette différence de [Ca2+]i. L’élévation de la [Ca2+]i pourrait donc être due à l’interaction entre le R-1 et le R-IP3 comme décrit précédemment (cf.

Introduction section III-2), cette interaction faciliterait la sortie de calcium du RE en

absence de toute stimulation extérieure. Or nos résultats montrent que dans les cellules HepG2 comme dans les hépatocytes primaires, le R1 ne modifiait pas le fonctionnement des R-IP3 (Abou-Lovergne, Collado-Hilly et al. 2011). Cette élévation de la [Ca2+]i semble donc être le résultat d’une diminution de la prise de calcium par le RE.

Nous avons donc mesuré la quantité de calcium contenue dans le RE. Ces expériences ont été réalisées en absence de calcium extracellulaire de façon à ce que les variations de calcium ne soient pas masquées par l’influx. Pour cela, étant donné que l’entrée de calcium dans le RE est le fait des pompes SERCA, nous avons incubé les cellules avec le 2,5-Di-(tert-butyl)-1,4- benzohydroquinone (tBuBHQ), un inhibiteur réversible de la pompe SERCA, 3 minutes après le début de l’expérimentation. Ceci nous a permis d’observer la sortie passive de calcium du RE. L’analyse des courbes indique que la « taille » du RE est plus faible dans les cellules du Clone 9 que dans les cellules HepG2 : 118+3 vs 140+4 (figure 34) p<0,05.

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Figure 34 : Le R-1 provoque une augmentation de la [Ca2+]i et une diminution du pool

calcique intracellulaire dans les cellules du Clone 9.

Les cellules HepG2 et Clone 9 sont ensemencées à 2,5.105 cellules/puits dans une plaque 6 puits dans du milieu DMEM+Glutamax en présence de SVF. A J3, les cellules sont chargées avec 3µM de Fura2-AM pendant 30min dans du mileu de William modifié. Les mesures de [Ca2+] sont obtenues avec une station de vidéo-microscopie sur un microscope inversé (Zeiss Axiovert 35). Les cellules sont ensuite placées dans un milieu d’imagerie sans calcium en

l’absence de stimulation afin d’obtenir la [Ca2+

]i. La fluorescence à 380nm est digitalisée

grâce au logiciel Metafluor (Princeton USA). Afin de mesurer la taille du pool calcique des cellules HepG2 et Clone 9 nous avons ajouté µM de tBuBHQ qui inhibe l’activité de la SERCA, le RE se vide donc passivement. La mesure de la fluorescence ainsi générée permet de mettre en évidence le fait que la « taille » du RE est plus petite dans les cellules Clone 9 que dans les cellules HepG2.

Afin de nous assurer que ces différences n’étaient pas dues à un effet clonal, nous avons fait ces mêmes mesures de calcium sur des cellules HepG2 transfectées de façon transitoire avec une de nos constructions R-1-GFP (la GFP est également en position N terminale) (figure 35). Les cellules HepG2 qui ont été transfectées avec succès avec le R-1-GFP présentent également une [Ca2+]iplus élevée que celles qui n’ont pas été transfectées.

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Figure 35 : Mesures de variations de calcium dans les cellules HepG2 et dans les cellules HepG2 transfectées transitoirement avec le R-1/GFP.

Les cellules HepG2 sont ensemencées à 2,5.105 cellules/puits dans une plaque 6 puits dans du milieu DMEM+Glutamax en présence de SVF. A J1, les cellules sont transfectées avec le R- 1/GFP. A J3, les cellules sont chargées avec 3µM de Fura2-AM pendant 30min dans du milieu de William modifié. Les cellules sont ensuite placées dans un milieu d’imagerie sans

calcium afin d’obtenir la [Ca2+

]i. Les mesures de [Ca2+] sont obtenues avec une station de

vidéo-microscopie sur un microscope inversé (Zeiss Axiovert 35). Après excitation de la

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numérisée grâce au logiciel Metafluor (Princeton USA) et le ratio des intensités de fluorescence (R) est alors calculé. Les cellules sont ensuite traitées avec de la Ionomycine

(ionophore calcique) afin d’obtenir le maximum de fluorescence (Rmax), puis par l’EGTA (chélateur du calcium) afin d’obtenir le minimum de fluorescence (Rmin). Les concentrations

de calcium cytosolique (fig.35B) sont calculées grâce à la formule présentée dans la section VI des Matériels et Méthodes. Les mesures de calcium sur des cellules HepG2 contrôles et des cellules HepG2 transfectées de façon transitoire avec la protéine R-1/GFP chargées avec le Fura2 montrent que la [Ca2+]i est plus élevée dans les cellules transfectées par le R-

1/GFP. Les courbes ci-dessus sont représentatives des signaux calciques observés dans 12 expériences indépendantes.

b) Impact de la surexpression du R-1 sur les cinétiques d’accumulation et de libération de calcium mitochondrial

Comme je l'ai indiqué précédemment, il a été montré sur des cellules CHO, que le R-1 pouvait modifier la prise de calcium par les mitochondries (Hayashi and Su 2007).

Nous avons réalisé les mesures de calcium mitochondrial sur cellule unique grâce à la sonde calcique 4mtD3CPV (cf Matériel et Méthodes I-2) (Nagai, Sawano et al. 2001).

Juste avant de débuter l’expérience, le milieu de culture est retiré et remplacé par le milieu d’imagerie (cf. Matériel et Méthodes I-3), les cellules sont ensuite stimulées par de l’ATP à 5 µM. Suite à la stimulation, le ratio 535 nm/480 nm augmente, indiquant une élévation de la concentration de calcium dans la matrice mitochondriale. En comparant les signaux obtenus pour les cellules HepG2 et les cellules du Clone 9, aucune différence significative des cinétiques d’accumulation et de libération de calcium par les mitochondries n’a pu être observée (figure 36).

Ces résultats suggèrent que dans les cellules du Clone 9, la surexpression du R-1 n’a pas d’effet sur la vitesse et la capacité de stockage des ions calcium dans les mitochondries en comparaison aux cellules HepG2.

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Figure 36 : La surexpression du R-1 n’affecte pas les cinétiques d’accumulation et de libération du calcium dans les mitochondries dans le Clone 9.

Les cellules HepG2 et Clone 9 sont ensemencées à 2,5.105 cellules/puits dans une plaque 6 puits dans du milieu DMEM+Glutamax en présence de SVF. Le lendemain les cellules sont transfectées avec la sonde pericam 4mtD3CPV. A J3, les cellules sont placées dans le milieu

d’imagerie et stimulées par 10µM d’ATP. Les mesures de [Ca2+

] sont obtenues avec une station de vidéo-microscopie sur un microscope inversé (Zeiss Axiovert 35). Le ratio de la fluorescence à 480nm et à 535nm (ratio 535nm/480nm) est calculé grâce au logiciel Metafluor (Princeton USA). N=4.