4 Identification de la cible du récepteur sigma 1 : Serca2

La surexpression du R-1 semble donc avoir pour effet, dans les cellules du Clone 9, la diminution de l’accumulation de calcium dans le RE (cf. section I-3 a). De plus les pompes SERCA sont responsables de l’entrée active de calcium dans le lumen. Nous avons donc

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étudié les liens entre le R-1 et la pompe SERCA 2 (la pompe SERCA majoritaire dans les cellules HepG2).

a) Immunoprécipitation du récepteur sigma 1

Pour mettre en évidence une interaction physique entre ces deux protéines nous avons procédé à des expériences d’immunoprécipitation. Notre première démarche a été l’immunoprécipitation directe du R-1 grâce à l’anticorps dirigé contre le R-1 covalab (cf. Matériel et Méthodes section I). Les résultats n’ont pas été concluants notamment du fait de la faible capacité de liaison de l’anticorps aux billes de sépharose.

Toutefois, la protéine de fusion que nous avons surexprimée dans les cellules du Clone 9 porte un tag c-myc. C’est grâce à cette étiquette que nous avons procédé à l’immunoprécipitation sur des microsomes. Le résultat de l’immunoprécipitation est ensuite déposé sur gel de polyacrylamide et analysé par western blot (figure 37). La protéine SERCA 2 co-immunoprécipite avec la protéine R-1/c-myc dans les cellules du Clone 9.

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Figure 37 : La protéine SERCA 2 co-immunoprécipite avec le R-1/c-myc dans les cellules du Clone 9.

A J3, les cellules HepG2 et Clone 9 en culture dans du milieu DMEM+Glutamax en présence de SVF sont récoltées afin d’isoler la fraction microsomale par centrifugations différentielles. A partir des microsomes, le R-1/c-myc est immunoprécipité grâce au peptide c-myc (Kit Pierce©). Les micromes (membrane RE) et l’immunoprécipité sont ensuite déposés sur un gel de 10% de polyacrylamide puis transférés sur une membrane de nitrocellulose 0,22µm. La membrane est incubées toute la nuit à 4°C avec un anticorps polyclonal de lapin au 1/500ème dirigé contre la SERCA 2b et un anticorps monoclonal de souris au 1/500ème dirigé contre le peptide c-myc (BD Biosciences). La membrane est ensuite analysée par Western blot grâce à des anticorps secondaires couplés à la HRP. La protéine SERCA 2b est révélée dans

l’échantillon issu de l’immunoprécipitation du R_{-1/c-myc dans les cellules du Clone 9. Ce}

western blot est représentatif de 4 expériences indépendantes.

b) Localisation subcellulaire du R-1 et de la SERCA2 dans les cellules HepG2 et les cellules du Clone 9

Nous avons réalisé des expériences d’immunocytochimie sur les cellules du Clone 9 en utilisant des anticorps dirigés contre le R-1/c-myc et la protéine SERCA 2 (cf. Matériel et Méthodes I) afin de vérifier que le R-1 et la SERCA 2 interagissaient in situ dans les cellules HepG2 et les cellules du Clone 9. Les localisations subcellulaires du R-1/c-myc et de la SERCA 2b sont semblables dans les cellules du Clone 9 (figure 38). Toutefois la résolution

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maximale du système optique (200 nm) ne permet pas de dire si elles interagissent ou si elles sont juste voisines.

Figure 38 : Le R-1/c-myc et la protéine SERCA 2b possèdent des localisations subcellulaires similaires dans les cellules du Clone 9.

Les cellules Clone 9 sont ensemencées à 2,5.105 cellules/puits dans une plaque 6 puits dans du milieu DMEM+Glutamax en présence de SVF. A J3, les cellules sont fixées à l’éthanol et

perméabilisées avec de l’acétone. L’immunomarquage est réalisé en utilisant l’anticorps

monoclonal de souris dirigé contre le peptide c-myc dilué au 1/100 (BD Biosciences) et

l’anticorps polyclonal de lapin dirigé contre la Serca 2b . Les cellules sont ensuite incubées avec un anticorps secondaire complexé à l’alexa fluor 5-546 pour réveler le R-1/c-myc et à l’Alexa 488 pour révéler la SERCA 2b. Les lames sont observées au microscope confocal, aux longueurs d’ondes λexc=488nm ; λem= 520nm (Vert) et λem=585nm (Rouge). La

photographie en haut à gauche et en vert représente la distribution de la SERCA 2b. Celle qui se trouve en haut à droite et en rouge, représente la distribution de la protéine R-1/c-myc. Les deux images ont ensuite été superposées (merge). Ce marquage immunocytochimique est représentatif de 6 expériences indépendantes, et pour chacune 6 champs ont été photographiés et analysés.

C’est pourquoi nous avons utilisé la technologie Duolink©, qui est également une technique d’immunohistochimie (cf. Matériel et Méthodes I-7-c). Les points rouges présents sur la figure ci-après sont le résultat de l’amplification qui a lieu si et seulement si les deux protéines, ici R-1 et SERCA 2, sont à moins de 30 nm de distance. Les résultats montrent que le R-1 se situe à proximité immédiate de la protéine SERCA 2 et que le traitement par un siRNA dirigés contre le R-1 réduit cette interaction (figure 39).

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Figure 39 : Le R-1 et la protéine SERCA 2 se situent à moins de 40 nm l’un de l’autre, dans les cellules HepG2 et les cellules du Clone 9.

Les cellules HepG2 et Clone 9 sont ensemencées à 2,5.105 cellules/puits sur une plaque 6 puits dans du milieu DMEM+Glutamax en présence de SVF. Les cellules HepG2 (A) et Clone 9 (B) ont été traitées à J1 avec un siRNA dirigés contre le R-1. A J3, les cellules sont fixées

par de l’éthanol à 4°C et perméabilisées par de l’acétone. Nous avons alors utilisé la

méthode Duolink© (cf. Matériel et Méthodes) qui permet de visualiser les situations où les protéines sont distantes au maximum de 40 nm par des points de fluorescence (ici en rouge). Les noyaux ont été marqués en bleu grâce au DAPI. Sur les histogrammes à droite, sont représenté le nombre de points de fluorescence rapporté au nombre de noyaux par champ observé (C et D). Les résultats présentés ici ont été répétés N=4 avec 6 champs choisis au hasard pour chaque condition. Chaque barre des histogrammes représente la moyenne + SEM. * :p<0,05 par rapport au contrôle.

En conclusion, la surexpression du R-1 dans les cellules du Clone 9 issues des cellules HepG2 ne semble pas affecter l’homéostasie du calcium mitochondrial. En revanche nos résultats montrent que la surexpression du R-1 dans ces mêmes cellules a pour effet une élévation de la concentration en calcium de base. Nous avons également pu mettre en évidence un lien direct entre la surexpression du R-1 et cette [Ca2+]i plus élevée dans les cellules du Clone 9. Nous avons également mis en évidence une interaction entre le R-1 et la SERCA 2. De plus nos expériences de dose-réponse à l’ATP montrent que la surexpression du R-1 n’affecte pas le fonctionnement du R-IP3. Nos résultats suggèrent que dans les

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cellules du Clone 9, la surexpression du R-1 a pour conséquence une altération de l’activité de la pompe SERCA 2.

Il a été montré dans des lignées de cellules neuronales que les agonistes du R-1 potentialisent l’ouverture du R-IP3 suite à une stimulation par la bradykinine (Hayashi, Maurice et al. 2000; Hong, Nuwayhid et al. 2004). Or nos résultats suggèrent que la surexpression du R-1 n’affecte pas le fonctionnement des R-IP3 dans les cellules HepG2 et Clone 9. A ce jour la fonction physiologique du R-1 reste inconnue. Il a été montré que le R-1 jouait un rôle important dans les phénomènes neuroprotecteurs (Nakazawa, Matsuno et al. 1998), le cancer (Spruce, Campbell et al. 2004), les phénomènes d’addictions (Liu, Chen et al. 2005), la protection face la toxicité des -amyloïdes dans le développement de la maladie d’Alzheimer (Marrazzo, Caraci et al. 2005), la protection contre l’hypertrophie cardiaque (Tagashira and Fukunaga 2012). La diversité des processus dans lesquels le R-1 est impliqué dépend certainement de la diversité de ses cibles et partenaires au travers des différents types cellulaires dans lesquels il est exprimé.

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I – Discussion générale et Perspectives

Le but de mon étude était de combiner des approches expérimentales et computationnelles pour déterminer la contribution des mitochondries dans la régulation des oscillations de calcium dans les hépatocytes.

Pour cela nous avons modifié l’expression de 2 protéines décrites comme pouvant être impliquées dans la prise de Ca2+ par les mitochondries : Hint 2 et R-1. Nous avons donc étudié l’effet des protéines Hint2 et R-1 sur les oscillations de calcium cytosoliques dans les hépatocytes et les cellules HepG2 issues d’un hépatocarcinome respectivement. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à leurs effets sur les cinétiques d’accumulation du calcium par les mitochondries.

I-1 Rôle de Hint2 dans la régulation des oscillations de calcium cytosolique