Chapitre 3 : Le récepteur sigma-1
III- 2 Analyse qPCR des ARN extraits des foies de souris WT et KO Hint2 /
Transcription Inverse
Pour chaque condition, 1 µg d’ARN est mis en présence de :
- 4 µL de tampon 5X (tampon pour l’enzyme) - 0,5 µL de random primers
- 4 µL de dNTP à 10 mM - 2 µL de DTT 0,1 M
- 1 µL de l’enzyme SuperScript II ©
Ce mélange est ensuite incubé 1 heure à 42°C afin de permettre l’amplification des fragments d’ADN complémentaire (ADNc) avant de stopper la réaction par passage à 95°C 5 minutes (dénaturation de l’enzyme). Après l’ajout de 40 µL d’eau RNase free les ADNc peuvent être conservés à -20°C.
PCR en temps réel
Un mix est préparé pour chaque gène à tester. Ce mélange réactionnel contient pour chaque puit de la plaque de PCR 96 puit :
- 4,26 µL d’eau RNase free - 0,12 µL d’oligo sens - 0,12 µL d’oligo antisens - 7,5 µL d’enzyme Sybergreen© - 3 µL d’ADNc
66
Chaque condition est réalisée en double. Le programme utilisé est le même pour chaque amplification. Le mélange est amené à 95°C pendant 10 minutes afin d’activer la polymérase. Puis il subit 40 cycles d’amplification (30 secondes à 94°C et 1 minute d’élongation à 60°C). Une mesure est effectuée à chaque cycle afin d’avoir l’évolution de l’amplification par le logiciel Opticon Monitor 3 (Biorad). Cela va permettre de ne prendre en compte que les mesures obtenues pendant la phase linéaire d’élongation. Pendant ces mesures, une courbe de fusion est réalisée afin de s’assurer grâce à la température du point de fusion Tm, que l’amplification génère un seul produit qui est spécifique des oligos utilisés.
IV - Culture cellulaire
Le modèle cellulaire utilisé pour l’étude du rôle du récepteur sigma 1 est celui des cellules HepG2 issues d’un hépatocarcinome humain et provenant de l’ATCC. Les cellules sont cultivées dans un incubateur à 37°C sous 5%/95% de CO2/O2. Le milieu de culture des cellules HepG2 est un milieu D-MEM Glutamax GIBCO (Invitrogen), enrichi en glucose (4,5g/l) mais dépourvu de pyruvate, supplémenté de 10% de sérum de veau fœtal (SVF) et d’antibiotiques à 1% (Pénicilline –Streptomycine-Fungizone). Deux fois par semaine, les cellules HepG2 subissent un passage, c'est-à-dire qu’elles sont trypsinisées (Trypsine-EDTA, Invitrogen) 5 min à 37°C et réensemencées à la dilution voulue (soit 2 millions de cellules par flasque de 75 cm²).
A partir des cellules HepG2, un clone stable appelé Clone 9 a été créé. La séquence d’ADN complémentaire humain du récepteur sigma-1 a été extraite d’un plasmide pcDNA3 (gracieusement donné par le Dr. François Monnet) après digestion par les enzymes de restrictions HindIII et XbaI. Cette séquence a ensuite été introduite dans un plasmide pCMV- cMyc-c (Stratagène©) après digestion par les enzymes de restriction HindIII et ApaI. La protéine de fusion ainsi élaborée porte un tag c-myc en position N terminale du récepteur sigma-1, en effet la liaison des ligands du R-1 se fait sur l’extrémité C terminale.
67
V - Mesures de calcium mitochondrial dans les cellules HepG2 et Clone 9
Les mesures de calcium sont réalisées grâce à une sonde ratiométrique appelée caméléon (biosenseur du calcium) adressée dans la mitochondrie (généreusement fournie par le Dr. Nicolas Demaurex). Elle est obtenue à partir d’un plasmide pcDNA3 contenant la séquence de la sonde calcique sous le contrôle d’un promoteur CMV(Cytomégalovirus) : 4mtD3CPV. Ce biosenseur contient une CFP (Cyan Fluorescent Protein) et une YFP (Yellow Fluorescent Protein) reliées par un fragment de calmoduline, couplé au fragment M13 de la kinase des chaines légères de la myosine qui change de conformation suite à la fixation de 4 atomes de calcium. Le KD du 4mtD3CPV est de 0.6 µM. Suite à ce changement de conformation, les fragments CFP et YFP se rapprochent et sont alors capables de transfert d’énergie de type FRET (figure 29).
La veille de la transfection, les cellules sont ensemencées, à une densité de 2.5.105 par puits d’une boite de Pétri 6 puits, sur une lamelle en verre de 24 mm de diamètre pour l’imagerie calcique. Les cellules sont transfectées transitoirement avec le caméléon dirigé aux mitochondries 4mtD3CPV deux jours avant les mesures en utilisant le Fugen HD en accord avec le protocole établit par le fournisseur.
68
Figure 29 : Représentation schématique de la sonde caméléon 4mtD3-CPV. (Miyawaki, Llopis et al. 1997)
Le biosenseur 4mtD3-CPV est composé de deux protéines fluorescentes : CFP (Cyan Fluorescent Protein) et YFP (Yellow Fluorescent Protein). Ces deux protéines sont reliées par la calmoduline (CaM) et un fragment de la kinase des chaines légères de la myosine du muscle squelettique (M13). Suite à la fixation de 4 atomes de calcium, le fragment M13 se lie à la CaM entrainant un rapprochement de la YFP et de la CFP permettant ainsi le FRET.
Les cellules sont excitées à une longueur d’onde de 440 nm. Les mesures de calcium sont réalisées sur une station de vidéo-microscopie sur un microscope inversé (Zeiss Axiovert 35). La fluorescence est recueillie alternativement à 480 et 535 nm. Les images sont collectées et analysées via le logiciel Simple PCI © afin d’obtenir le ratio 535/480 (figure
69
Figure 30 : Expression de la sonde 4mtD3CPV dans les mitochondries des cellules HepG2.
La transfection des cellules HepG2 par la sonde 4mtD3CPV est visualisée ici dans le panneau supérieur après excitation et aux deux longueurs d’ondes d’émissions. Les signaux sont ensuite intégrés par le logiciel Simple PCI©. Il en résulte une courbe pour chaque
longueur d’onde représentant la fluorescence en fonction du temps. Le logiciel permet de plus d’obtenir le ratio 535nm/480nm qui représente directement les variations de calcium dans la matrice mitochondriale suite à la stimulation par l’ATP (ici : 30 µM).
VI - Mesures de calcium cytosolique dans les cellules HepG2 et Clone 9
Les cellules sont chargées avec la sonde ratiométrique Fura2-AM (AcetoxyMethyl ester) à 3 µM pendant 20 minutes à 37°C dans l’incubateur. La fluorescence suite à l’excitation à 340 nm et à 380 nm est alors recueillie par vidéo-microscopie sur un microscope inversé (Zeiss Axiovert 35).Les images sont collectées par une caméra CCD (Princeton USA). Elles sont ensuite digitalisées et le ratio 340/380 est alors calculé grâce au logiciel Metafluor (Princeton USA). Toutes les expériences ont été réalisées sur différents
70
passages cellulaires (4<N<7) et pour chaque champ observé plusieurs cellules ont été sélectionnées. Le nombre n exprimé dans les résultats, correspond au nombre total de cellules observées sur ces différents champs.
Les cellules sont mises dans un milieu d’imagerie mimant le milieu extracellulaire (20 mM HEPES, 116 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2, 0.96 mM NaH2PO4, 5 mM NaHCO3, and 1 g/l glucose, pH 7.4) afin de mesurer la concentration de calcium de base selon la formule : [Ca2+]c = Kd * b * [(R - Rmin)/(Rmax - R)]. Les cellules sont ensuite mises dans le même milieu à l’unique différence qu’il ne contient pas de calcium (milieu calcium 0) de façon à mesurer les variations de calcium cytosolique en s’affranchissant de l’influx calcique.
L’application de tBUBHQ à 30 µM, un inhibiteur des pompes SERCA permet ensuite de vider les stocks intracellulaires par diffusion passive, et nous permet de quantifier la taille des pools calciques.