Sumoylation de E1 par Ubc9

En plus de la phosphorylation, il a été démontré que la sumoylation pouvait moduler le transport intracellulaire d’une protéine ainsi que sa localisation intranucléaire (Pichler and Melchior, 2002). À titre d’exemple, on retrouve l’hélicase BLM et la protéine adénovirale E1B 55-KDa, dont l’accumulation respective dans les foyers nucléaires de PML et au noyau est dépendante de leur sumoylation (Eladad et al., 2005; Endter et al., 2001).

Plusieurs études démontrent que E1 interagit avec Ubc9, une enzyme médiant la conjugaison de la protéine SUMO (Small Ubiquitine-like MOdifier) (Chapitre 2 et (Rangasamy and Wilson, 2000; Yasugi and Howley, 1996; Yasugi et al., 1997b)). Chez les eucaryotes, la voie de sumoylation est régulée par quatre protéines ou groupes de protéines, dont trois assurent la conjugaison de la protéine SUMO : 1) la protéine activatrice E1 (SAE1/SAE2), 2) la protéine de conjugaison E2 (Ubc9) et 3) différentes protéines E3 ligases. Le rôle du quatrième groupe de protéines est d’assurer la dé-congugaison de la SUMO : les isopeptidases (Fig. 1.17) (Gareau and Lima, 2010; Pichler and Melchior, 2002). Contrairement à la voie de l’ubiquitination, où la spécificité du transfert de l’ubiquitine est médiée par les E3 ligases, la spécificité du transfert de la protéine SUMO est dictée par la protéine Ubc9. Ainsi, Ubc9 cible spécifiquement les protéines en liant un site consensus composé de ψ-K-x-D/E (où ψ est un acide aminé hydrophobe) (Bernier- Villamor et al., 2002; Sampson et al., 2001). La sumoylation module plusieurs processus cellulaires tels que la transcription (Mascle et al., 2007; Melchior and Hengst, 2002), la réparation de l’ADN (Matunis, 2002) ainsi que le transport intracellulaire et intranucléaire (Pichler and Melchior, 2002; Terui et al., 2004).

Figure 1.17. Voie de sumoylation chez les eucaryotes.

La première étape de la voie de sumoylation consiste à charger la protéine SUMO sur la protéine activatrice E1 (SAE1/SAE2) via la formation d’un lien thioester. Ensuite, la protéine SUMO est transférée sur la protéine de conjugaison E2 (Ubc9). La protéine E2 reconnaît ensuite un site de sumoylation spécifique du substrat (_ψ-K-x-D/E) et transfert la SUMO directement sur la lysine du site consensus retrouvé dans la protéine cible via la formation d’un lien isopetide. Bien que la présence de E3 ligases (ex. : PIAS et RanBP2) favorise le transfert, celles-ci ne sont pas requises pour la spécificité de la sumoylation. Finalement, les isopeptidases (ex. : SENP) sont responsables de retirer la protéine SUMO de la protéine cible en plus d’être nécessaire à la maturation de la SUMO avant son chargement sur la protéine activatrice E1. La protéine Gam1, qui inhibe l’activité ainsi que la stabilité des sous-unités de la protéine activatrice E1, et Ubc9 sont aussi représentées.

Les protéines E1 du VPH 11, du VPH 16 et du VPB interagissent avec Ubc9 in vitro ainsi que dans des essais de type double hybride chez levures. Bien qu’il ait été démontré

que certains mutants de E1 incapables d’interagir avec Ubc9 soient inaptes à répliquer l’ADN viral (S310R, Y392F, W419R, G462D et G476R), il demeure difficile de déterminer la fonction de l’interaction E1-Ubc9 au cours de la réplication virale puisque les mutants en question affectent aussi d’autres fonctions essentielles de E1 (Chapitre 2 et (Yasugi et al., 1997b)). En plus d’interagir avec Ubc9, une série d’études rapporte que la protéine E1 est sumoylée in vitro et in vivo et que cette modification augmente l’interaction de VPB E1 avec Crm1 (Hsu et al., 2007; Rangasamy and Wilson, 2000; Rangasamy et al., 2000; Rosas-Acosta et al., 2005; Rosas-Acosta and Wilson, 2008). Plus précisément, il a été rapporté que les protéines E1 des VPH 1, 11, 18 et du VPB peuvent être sumoylées dans un système in vitro en présence des protéines SAE1/SAE2, Ubc9 et des E3 ligases de la famille PIAS (PIAS1, ARIP3 et Miz2) (Rangasamy and Wilson, 2000; Rosas-Acosta et al., 2005). Des études ont également montré qu’il est possible de détecter la sumoylation de la protéine E1 du VPB in vivo (Rangasamy et al., 2000; Rosas-Acosta et al., 2005) et que les formes sumoylées de E1 interagissent davantage avec Crm1 en GST-pulldown (Rosas- Acosta and Wilson, 2008). Malgré ces études, il nous a personnellement été impossible de détecter la sumoylation des protéines E1 du VPH 11 et du VPB in vivo et ce, même si nous avons été en mesure de démontrer que la protéine PML, une protéine dont la sumoylation est bien caractérisée, était efficacement sumoylée dans ces mêmes conditions (Chapitre 2).

Dans les études ayant décrit la sumoylation de E1, il a également été démontré que la mutation de lysines et d’une leucine conservées (K538R ou A, L444P/K445A) dans le domaine C-terminal de E1 abolit la sumoylation de E1 et inhibe la réplication virale (Rangasamy and Wilson, 2000; Rangasamy et al., 2000). Bien que la caractérisation de ces mutants en microscopie ait d’abord permis à ces auteurs de stipuler que la sumoylation régulait la localisation cellulaire de E1, ils ont été incapables de reproduire le même phénotype à travers trois différentes études. Ainsi, selon l'étude, différentes localisations cellulaires des mutants de E1 ont été répertoriées : au cytoplasme, dans des sous-domaines nucléaires ou au noyau (Rangasamy and Wilson, 2000; Rangasamy et al., 2000; Rosas- Acosta and Wilson, 2008). Au cours de l’étude présentée dans cette thèse, l’analyse de la

localisation de la protéine E1 du VPH 11, du VPH 16 et du VPB a déterminé que la voie de sumoylation n’est pas nécessaire à l’accumulation nucléaire de E1 (Chapitre 2). Plus précisément, l’utilisation de la protéine Gam1 de l’adénovirus de type aviaire CELO (Boggio and Chiocca, 2005; Boggio et al., 2004; Chiocca, 2007), une protéine qui inhibe l’activité SAE1/SAE2 et induit la dégradation de SAE1/SAE2 et de Ubc9 (Fig. 1.17), a permis de démontrer que bien que la voie de sumoylation soit nécessaire à l’accumulation de PML dans des foci nucléaires, son inhibition n’interfère pas avec l’accumulation nucléaire de E1 du VPH 11, du VPH 16 et du VPB (Chapitre 2 et (Shen et al., 2006)). Nous avons également démontré que, contrairement aux résultats obtenus avec la protéine E1 du VPB, l’acide aminé K538 n’est pas essentiel à la réplication de l’ADN du VPH 11. Malgré la divergence des résultats obtenus au cours des études sur le rôle de la voie de sumoylation dans la localisation cellulaire de E1, toutes s’entendent pour dire que la protéine est capable d’interagir avec la protéine de conjugaison Ubc9. Le rôle de cette interaction reste toutefois à être défini.