Interaction de E1 avec des protéines cellulaires

1.4.2.1.1 Protéines du réplisome

Les études faites sur le VPH suggèrent que la réplication de son ADN est semi- conservative, c’est-à-dire que le nouvel épisome synthétisé contient un nouveau brin d’ADN et un brin de l’ADN parental (Melendy et al., 1995). Pour ce faire, E1 s’associe avec des composantes du réplisome cellulaire (Johnson and O'Donnell, 2005). Tel que mentionné au tout début de cette section, ce complexe cellulaire contient plusieurs protéines ayant un rôle spécifique au cours de l’élongation de la réplication. Ainsi, la sous- unité primase de la polymérase α-primase enclenche le processus en produisant de petites amorces d’ARN, puis sa sous-unité polymérase les utilise pour synthétiser les amorces d’ADN sur le brin avancé et les fragments d’Okasaki sur le brin retardé (Fig. 1.12). La création de nouveaux brins d’ADN à partir de ces amorces est ensuite assurée par la polymérase δ sur le brin retardé et par la polymérase ε sur le brin avancé. Le chargement de ces polymérases sur l’ADN est assuré par le complexe RFC-PCNA qui se forme au bout 3’ de l’amorce d’ADN, déplace la polymérase α-primase et stabilise le complexe polymérase δ (ou ε)-PCNA-ADN (Johnson and O'Donnell, 2005; Moldovan et al., 2007; Sclafani and Holzen, 2007; Waga and Stillman, 1998). Suite au déroulement de l’ADN, les deux brins sont maintenus ouverts grâce à RPA, une protéine liant l’ADN simple brin, et les torsions de l’ADN induites par son déroulement sont relâchées par l’action des topoisomérases I et II (Branzei and Foiani, 2010; Waga and Stillman, 1998).

L’importance de ces protéines au cours de la réplication de l’ADN viral par E1 et E2 fut mise en évidence dès les premières analyses de la réplication de l’ADN du VPH 11 et du VPB in vitro. Plus particulièrement, il a été démontré que la réplication de l’ADN dans des extraits cellulaires est inhibée en présence d’anticorps ou d’inhibiteurs spécifiques ciblant la polymérase α, PCNA, RPA et les topoisomérases I et II (Kuo et al., 1994; Park et

al., 1994). De plus, grâce au fractionnement de l’extrait cellulaire capable de supporter la réplication de l’ADN du VPB in vitro, il a été démontré que la protéine RFC ainsi que de la polymérase δ sont également essentielles à la réplication du génome viral (Melendy et al., 1995). Dans certains cas, des analyses biochimiques ont permis de mieux définir les interactions entre E1/E2 et ces protéines. Il est cependant important de noter qu’à l’exception de la polymérase α-primase, toutes les interactions ont été rapportées uniquement pour la protéine du VPB E1.

Figure 1.12. Progression de la fourche de réplication au cours de l’élongation de l’ADN chez les eucaryotes.

Chaque composante du réplisome décrite dans le texte apparaît sur cette figure. Bien que non représenté par une structure hexamérique, l’emplacement occupé par le complexe hélicase cellulaire (MCM-GINS-Cdc45) et l’hélicase virale (E1) au cours de la réplication est identifié. La figure a été adaptée à partir de Alberts et al. (2003) Nature (Alberts, 2003).

1.4.2.1.1.1 Polymérase α-primase

La polymérase α-primase contient quatre sous-unités : p48, la sous-unité catalytique primase, p180, la sous-unité polymérase, p58, une sous-unité auxiliaires, et p70, une sous- unité importante dans l’assemblage du complexe. Bien que deux études suggèrent que E1 interagisse avec la sous-unité p180, la majorité des études ayant caractérisé l’interaction entre E1 et la polymérase α rapportent que les protéines E1 du VPH et du VPB interagissent avec la sous-unité p70 du complexe polymérase in vitro ainsi que dans les levures, et non avec la sous unité p180 (Amin et al., 2000; Bonne-Andrea et al., 1995; Conger et al., 1999; Masterson et al., 1998; Park et al., 1994). Dans tous les cas, ces interactions sont dépendantes du domaine C-terminal de E1 et sont mutuellement exclusives aux interactions entre E1 et E2 (Fig. 1.7) (Amin et al., 2000; Masterson et al., 1998). Puisque E2 est nécessaire à la formation du complexe d’initiation de la réplication du VPH, cette observation suggère que la polymérase interagit avec l’hexamère de E1, c’est-à-dire lorsque E2 a été évincé du complexe (Fig. 1.8B).

1.4.2.1.1.2 RPA

RPA est composée de trois sous-unités : RPA32, RPA70 et RPA14. Bien que chaque sous-unité soit importante pour les fonctions de RPA, RPA70 serait responsable de la majorité des liaisons du complexe protéique à l’ADN ainsi qu’aux protéines cellulaires telles que la polymérase α (Braun et al., 1997; Dornreiter et al., 1992; Wold, 1997). L’interaction entre E1 et la sous-unité RPA70 a été observé dans des essais d’interaction protéine-protéine de type ELISA (Enzyme-Linked ImmunoaSorbent protein interaction Assay) et GST-pulldown, utilisant des protéines pures produites chez E. coli ou des protéines produites in vitro dans un système de réticulocytes de lapin (Han et al., 1999; Loo and Melendy, 2004). Dans ce type d’essai, les interactions entre RPA, E1 et l’ADN simple brin sont mutuellement exclusives (Loo and Melendy, 2004). En dépit de ces résultats in vitro et en accord avec les résultats de Bonne-Andrea et al, les chromatographies d’affinités faites dans notre laboratoire n’ont jamais permis de détecter l’interaction entre E1 et RPA

(Bonne-Andrea et al., 1995; Fradet-Turcotte and Archambault, Données non-publiées). Combinés, ces résultats suggèrent que l’interaction entre E1 et RPA est de faible affinité. Finalement, puisqu’il a déjà été rapporté que le TAD de E2 est également capable d’interagir avec RPA, il est possible que l’interaction in vivo soit favorisée en présence des deux protéines virales (Li and Botchan, 1993). Globalement, ces résultats suggèrent que RPA interagit faiblement avec E1 et E2.

1.4.2.1.1.3 Topoisomérase I

En clivant et re-liant l’ADN, les topoisomérases permettent de relaxer les torsions induites par le déroulement et la réplication de l’ADN. Tout comme RPA, les interactions des protéines E1 du VPH et du VPB avec la topoisomérase I ont seulement été identifiées in vitro. En fait, les études de GST-pulldown suggèrent que l’OBD et le domaine C- terminal de E1 interagissent avec la topoisomérase I, et que cette interaction stimulerait à la fois la liaison spécifique de E1 à l’ADN et l’activité de la topoisomérase I (Fig. 1.7) (Clower et al., 2006a; Hu et al., 2006). Comme E2 est également capable d’interagir et de stimuler l’activité de la topoisomérase I (Clower et al., 2006b), d’autres études seront essentielles afin de définir l’importance de ces interactions entre E1/E2 et la topoisomérase I.

1.4.2.1.2 p80

Aussi connue sous les noms de WDR48 et UAF1 (Usp1-Associated Factor 1), la protéine cellulaire p80 contient un domaine composé d’un motif WD40 répété qui est prédit pour s'assembler en une structure tertiaire en forme d’hélice de bateau à 8 pales (β- propeller) ainsi qu’un domaine composé de deux faisceaux d'hélices torsadées (coiled-coil) (Park et al., 2002). Les premières études de p80 ont été faites au début des années 2000 et ont démontré que la protéine Tip du virus de l’herpès Saimiri utilise p80 afin d’induire la dégradation des récepteurs T des lymphocytes (Park et al., 2003; Park et al., 2002). Bien que p80 ait d’abord été observée au niveau des lysosomes, des études récentes démontrent

que p80 interagit et module l’activité d’une protéine nucléaire. De manière plus précise, p80 lie et stimule l’activité de Usp1, une dé-ubiquitinase impliquée dans la régulation de plusieurs voie de réparation de l’ADN (Cohn et al., 2009; Cohn et al., 2007; Kee and D'Andrea, 2010). Plus précisément, Usp1 inhibe la voie de réparation de l’ADN de l'anémie de Fanconi en dé-ubiquitinant la protéine FANCD2 (Moldovan and D'Andrea, 2009a, b). De plus, en collaboration avec la protéine cellulaire ELG1, Usp1 dé-ubiquitine PCNA, dont les niveaux d’ubiquitination dictent son implication dans diverses voies de réparation de l’ADN (Brun et al., 2010; Huang et al., 2006; Lee et al., 2010; Niimi et al., 2008; Oestergaard et al., 2007). Finalement, une nouvelle étude démontre qu’Usp1 maintient la kinase Chk1 active suite à la stimulation de la voie de dommages à l’ADN dépendante de ATR (ATM and Rad3-related kinase) (Guervilly et al., 2011). En plus de Usp1, p80 interagit et stimule les activités de Usp12 et 46. Bien que les fonctions de ces Usp soient peu connues, la récente découverte que ces complexes dé-ubiquitinent les histones H2A et H2B suggère qu’elles pourraient jouer un rôle dans la régulation de la compaction de la chromatine (Cohn et al., 2009; Joo et al., 2011; Kee et al., 2010).

Dans notre laboratoire, l’étude des divers domaines fonctionnels de la protéine E1 du VPH 11 par une approche de type Tandem Affinity Purification (TAP) a permis d’identifier une nouvelle interaction entre la région N-terminale de la protéine virale et la protéine cellulaire p80 (Cote-Martin et al., 2008). Des méthodes de GST-pulldown et de co- immunoprécipitation ont ensuite permis d’établir que les acides aminés 10-40 sont essentiels à l’interaction de la protéine E1 des VPH 11 et 31 avec p80. La mutation d’acides aminés spécifiques hautement conservés de ce domaine permet d’abolir cette interaction (W17A/F18A, V20A/E21A ou V23A/I24A) (Fig. 1.7). In vivo, cette interaction permet à la protéine E1 du VPH 11 et 31 de relocaliser la protéine cytoplasmique p80 au noyau (Cote- Martin et al., 2008). Finalement, l’utilisation d’essais de réplication transitoire ainsi que l’introduction de mutations abolissant l’interaction E1-p80 dans un génome viral complet ont permis de démontrer que les protéines E1 mutantes étaient incapable de répliquer efficacement l’ADN et donc de maintenir le génome viral sous forme épisomale dans les

kératinocytes (Annexe 5 et (Cote-Martin et al., 2008)). En dépit de leur défaut de réplication, ces protéines sont toujours en mesure d’amplifier le génome du VPH suite à la différenciation des kératinocytes. Ce résultat suggère que la liaison de E1 à p80 n’est pas essentielle à l’amplification du génome et va de pair avec l’observation que la région N- terminale de E1 permettant la liaison à p80 est clivée par la caspase-3/-7 au cours de la différenciation des kératinocytes (Fig. 1.7 et section 1.4.2.2) (Moody et al., 2007). Bien que les fonctions exactes de l’interaction de E1 avec p80 soient encore mal définies, on sait qu’une protéine E1 incapable d’interagir avec p80 est toujours localisée au noyau cellulaire et interagit toujours spécifiquement et non spécifiquement avec l’ADN.

1.4.2.1.3 p56

Au début des années 1980, il a été démontré que la forme épisomale du génome du VPB n’est pas maintenue dans les cellules en présence d’interféron (IFN) (Turek et al., 1982). Le même phénotype a par la suite été observé dans les kératinocytes maintenant le génome du VPH 31 ou du VPH 16 (Chang et al., 2002; Herdman et al., 2006). Dès lors, il a été proposé que l’activation de la voie de l’interféron induisait une inhibition de la réplication de l’ADN viral. Ce n’est cependant que dernièrement qu’une partie du mécanisme moléculaire responsable de cette inhibition a été révélée. En fait, il a été découvert qu’une protéine induite par la voie de l’interféron, p56, lie E1 et interfère avec ses fonctions de réplication (Terenzi et al., 2008). Plus précisément, il a été démontré que le domaine N-terminal de p56 interagit avec les acides aminées 372-629 du domaine C- terminal de la protéine E1 et que cette interaction inhibe la réplication de l’ADN viral in vitro et in vivo (Fig. 1.7) (Saikia et al., 2010; Terenzi et al., 2008). Bien que p56 induise la relocalisation cytoplasmique de E1, les analyses biochimiques suggèrent que p56 inhiberait directement la réplication en inhibant la liaison spécifique de E1 à l’ADN, son interaction avec E2 ainsi que son activité hélicase (Saikia et al., 2010; Terenzi et al., 2008). Il a également été proposé que la phénylalanine 399 du VPH 18 (F399) serait importante à l’interaction entre E1 et p56. En fait, il a été démonté que la délétion de F399 n’affecte pas les fonctions de réplication de E1, mais les rendent insensibles à l’inhibition par p56 ainsi

que par les traitements à l’interféron (Saikia et al., 2010). Il est cependant important de noter que le rôle exact de cette phénylalanine dans l’interaction E1-p56 est difficile à évaluer, puisque nous avons démontré que sa mutation chez la protéine E1 de d’autres types de VPH inhibe ses activités de réplication (Annexe 5 et (Titolo et al., 2000; White et al., 2001)). Ainsi, bien que ces résultats permettent d’expliquer l’efficacité des traitements des infections au VPH par l’IFN ou par l’imiquimode (Section 1.2), les mécanismes moléculaires précis permettant à l’IFN et à p56 d’inhiber les fonctions de réplication de E1 restent à être identifiés et/ou confirmés chez les autres VPH.

1.4.2.1.4 Hsp40 et Hsp70

La famille des chaperonnes moléculaires est composée entre autre des protéines Hsp40 et Hsp70 (Heat Shock Protein), dont la fonction majeure est d’assister le repliement tridimensionnel des protéines au cours de leur formation de novo ou le dépliement des protéines au cours de processus tels que la dégradation (Bukau and Horwich, 1998). Ces chaperonnes sont en mesure de moduler les structures de leurs protéines cibles (aussi appelés clients) grâce à leur activité ATPase. Deux études suggèrent que la réplication des VPH requiert l’action de chaperonnes. Tout d’abord, l’implication des chaperonnes Hsp40 et 70 dans la modulation de la réplication a été démontrée chez la protéine E1 du VPH 11. Plus précisément, il a été démontré que le domaine J de Hsp40 ainsi que la protéine Hsp70 augmentent l’affinité de liaison de E1 à l’origine de réplication. De plus, des études in vitro démontrent que ces Hsp favorisent l’assemblage de doubles hexamères ainsi que l’initiation de la réplication (Liu et al., 1998). En fait, il a été suggéré que les Hsp réguleraient ces processus en facilitant l’éjection de la protéine E2 du complexe d’initiation de la réplication (Lin et al., 2002). Finalement, l’importance des Hsp dans la réplication de l’ADN des virus à ADN double brin a également été soulignée chez le SV40 où la réplication de l’ADN viral dépend de l’interaction du domaine J de l’AgT avec les chaperonnes Hsp40 et Hsp70 (Campbell et al., 1997; Sullivan and Pipas, 2002).

1.4.2.1.5 hSNF5 et H1

SWI/SNF est un complexe de remodelage de la chromatine qui inhibe ou active la transcription selon qu’il favorise ou non l’ouverture de la chromatine au niveau de promoteurs spécifiques (Sudarsanam and Winston, 2000). Ce complexe contient une activité ATPase lui permettant de moduler l’interaction des histones avec l’ADN. L’interaction de E1 avec les acides aminés 182-331 de la sous unité Ini1/hSNF5 du complexe cellulaire SWI/SNF a d’abord été identifiée chez la protéine du VPH 18, puis elle a été confirmée chez le VPH 11 et le VPB (Lee et al., 1999). Au niveau de la protéine E1, l’interaction requière la région 143-437 et peut être inhibée par la mutation de résidus spécifiques (S198P/F199S, L278K, N368H/A369E et N390E/Y391H) (Fig. 1.7). Bien que le rôle précis de cette interaction demeure inconnu, le fait que la réplication de l’ADN viral soit activée lorsque Ini1/hSNF5 est surexprimé, et réprimée lorsque son expression est inhibée par un ARN anti-sense, suggère que Ini1/hSNF5 favoriserait la réplication de l’ADN viral. Comme le génome du VPH est empaqueté sous forme de chromatine, et que la liaison de l’ADN viral par les nucléosomes inhibe sa réplication par les protéines E1 et E2, de même que l’expression des gènes viraux à partir du promoteur p97 (del Mar Pena and Laimins, 2001; Favre et al., 1977; Li and Botchan, 1994), il est possible que l’interaction de E1 avec le complexe SWI/SNF favorise la réplication de l’ADN et/ou la transcription des gènes viraux en induisant la déstabilisation des histones présentes dans le LCR (Tang et al., 2010).

En plus de son interaction avec un complexe de remodelage de la chromatine, il a été suggéré que E1 était capable d’évincer l’histone H1 de l’ADN viral au cours de sa réplication (Swindle and Engler, 1998). Dans les cellules eucaryotes, l’histone H1 est située entre deux nucléosomes et sert à compacter la chromatine (Raghuram et al., 2009). Ainsi, l’étude de Swindle et al, qui suggère qu’une région contenant les acides aminés 1-170 de E1 soit capable d’interagir avec l’histone H1, porte à croire encore une fois que E1 contribue à la déstabilisation de la chromatine au cours de la réplication (Fig. 1.7) (Swindle and Engler, 1998). De plus amples recherches seront toutefois nécessaires afin de déterminer le rôle

exact des interactions de E1 avec la sous unité Ini1/hSNF5 du complexe SWI/SNF ainsi qu’avec l’histone H1 au cours de la réplication de l’ADN viral.

1.4.2.1.6 E1-BP

L’interaction entre E1 et la protéine E1-BP a été identifiée au cours d’un crible de type double-hybride utilisant la protéine E1 du VPH 16 comme proie (Yasugi and Howley, 1996; Yasugi et al., 1997b). E1-BP est une protéine de 432 acides aminés contenant un site de liaison à l’ATP. Cette protéine serait une forme épissée de la protéine TRIP13 (Thyroid hormone Receptor Interactor Protein 13), soit une protéine interagissant avec les récepteurs d’hormones thyroïdiennes (Lee et al., 1995). La caractérisation de l’interaction entre E1 et E1-BP a démontré que toutes les protéines E1 contenant une mutation abolissant leur liaison à E1-BP (Y382F, W419R et L, G462D et G476R) étaient incapables de répliquer efficacement l’ADN du VPH in vivo (Yasugi et al., 1997b). Comme la fonction cellulaire exacte de E1-BP demeure toujours inconnue et que les mutants de E1 inhibant sa liaison à E1-BP sont aussi incapables d’hydrolyser l’ATP, de s’oligomériser ou de lier E2, d’autres études seront nécessaires pour déterminer le rôle spécifique de l’interaction E1-E1-BP au cours de la réplication de l’ADN viral.

1.4.2.2 Clivage d’une portion de la région N-terminale de E1 par les caspases-3 et -7