1.2.1.1 Substrats de culture 3D

Le cahier des charges des biocéramiques macroporeuses est à première vue assez simple. En résumé le matériau doit être biocompatible, ostéoconducteur, facilement stérilisable, faiblement dégradable dans le milieu de culture et d’architecture contrôlée. A ce titre, des architectures complexes telles les structures minimales triplement périodiques (e.g., gyroides), pressenties pour favoriser le développement tissulaire [155-161] auraient pu être étudiées. Toutefois, le contrôle des flux de perfusion à l’intérieur de telles structures et la modélisation des phénomènes physiques, chimiques et biologiques en leur sein peuvent s’avérer problématiques. C’est pourquoi nous nous sommes focalisés au cours de cette étude préliminaire sur des céramiques d’architectures simples afin de développer des modèles prédictifs. Autrement dit, l’idée est de pouvoir relier simplement l’architecture du substrat, induisant des contraintes fluidiques (e.g., flux de cisaillement) lors de sa perfusion, à un comportement cellulaire ; la complexification des structures et modèle prédictifs sera envisagée à postériori.

Par conséquent, et sur la base des travaux de l’équipe du Pr. Fratzl, l’architecture interne des biocéramiques a été conçue avec des géométries élémentaires en forme de canaux unidirectionnels de section circulaire ou triangulaire. Afin de conserver un débit de perfusion équivalent entre chaque biocéramique mais également chaque canal, qu’il soit de section triangulaire ou circulaire, le nombre de canaux unidirectionnels ainsi que l’aire de leur section se devaient d’être similaires.

La dimension et la forme générales des biocéramiques ont été contraintes par le système de fixation du biomatériau proposé de série sur le bioréacteur de perfusion Bose ElectroForce 5270 BioDynamic utilisé dans le cadre de ces essais. La fixation de la céramique est réalisée à l’aide de pistons cylindriques en acier inoxydable 316L de 10,4 mm de diamètre extérieur, et l’étanchéité à l’aide d’une jupe en silicone, telles que schématisées Figure IV-3. Ces spécifications nous ont ainsi conduits à fixer le diamètre des céramiques à 10,0 mm.

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Figure IV-3. Schéma du procédé de blocage du matériau à l’aide de deux pistons du système BOSE Electroforce 5270.

La hauteur des biocéramiques cylindriques, choisie à 5 mm, a fait l’objet de compromis entre (i) leur temps et leur coût de production, et (ii) les contraintes des protocoles biologiques. Parmi ces dernières nous pouvons citer la nécessité d’offrir une surface (et donc une hauteur) d’adhésion suffisante aux cellules pour l’étape d’ensemencement et leur développement ; une quantité de cellules minimum est nécessaire pour pouvoir réaliser les analyses quantitatives (e.g., qRT-PCR). La hauteur ne doit toutefois pas être trop importante compte tenu des limites de la microscopie confocale utilisée pour imager le dépôt de matrice dans les canaux. Ces deux dernières contraintes sont également à l’origine des spécifications du diamètre et du nombre de canaux. Le but étant de cultiver et de contrôler les cellules jusqu’à 3 semaines, des diamètres de canaux relativement larges devaient être choisis pour éviter leur obstruction trop rapide. Associés aux contraintes de diamètre de la biocéramique, d’équivalence des sections des canaux, 50 canaux de section circulaire (Ø » 740 µm) ou triangulaire (angles 90°, 45°, 45°, hypoténuse L = 1100 µm et petit côté l = 780 µm) ont été finalement insérés dans le volume de la céramique. La figure IV-4 présente les dessins CAO des moules et des biocéramiques conçues pour cette étude.

Biocéramique

Couche dense périphérique Macro-canaux orientés dans le

sens de perfusion « Jupe » en silicone Joints en polymère non toxique Fritté support Sens de perfusion Pistons de perfusion du dispositif Bose Cou ique re Ø matériau idéal 10,0 mm

Chapitre IV Mise en application des outils développés

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Figure IV-4. Représentation CAO des biocéramiques comportant chacune 50 canaux unidirectionnels de section circulaire (A1) ou triangulaire (B1) en vue isométrique et en vue de dessus et les moules respectivement utilisés pour leur production (B1 et B2). Le système d’armature soutenant les colonnes des moules (qui deviendront pour rappel les canaux des biocéramiques) est précautionneusement éliminé au cours du procédé de fabrication.

L’élaboration des biocéramiques en HA a suivi la procédure de fabrication détaillée dans le chapitre II à savoir la fabrication du moule (voir Figure IV-5, page 139), suivie des étapes d’imprégnation, de séchage, de déliantage puis de frittage.

Les paramètres de fabrication des moules ont été fixés par les contraintes liées à l’ensemencement des biocéramiques. En effet, l’adhésion cellulaire sur des surfaces en HA et l’ensemencement homogène de ces substrats de culture 3D sont loin d’être aisés. En réponse, les céramiques doivent présenter au sein des canaux une microtopographie (voir Figure IV-2) qui doit permettre en théorie de « piéger » les cellules (5 < Øcellules < 10 µm). La présence de cette microtopographie peut être obtenue en jouant sur deux paramètres : la résolution de fabrication du moule et la viscosité de la barbotine.

Les moules ont été produits par impression 3D (3Z studio, Multistation), les colonnes orientées selon l’axe z de l’imprimante (Figure IV-5), avec une résolution faible de 25 µm afin d’obtenir des « marches » d’une vingtaine de micromètres de profondeur et de largeur, positionnées perpendiculairement au sens du flux (voir Article 1, Chapitre II, page 37). L’obtention de ces marches est toutefois soumise à la préparation d’une suspension fluide capable de napper parfaitement les surfaces du moule. Cette dernière a ainsi été préparée, sur la base des résultats présentés au Chapitre II (Article 2, Chapitre II, page 47), avec une poudre d’HA de 4,0 m2 g-1, et un pourcentage en matière sèche de 73,6 % en masse. Ce pourcentage de matière sèche élevé pour notre procédé est également important pour limiter la quantité de micropores : en simplifiant, plus il y a d’eau dans une suspension et plus la céramique risque de comporter des micro- nano-pores (voir Figure IV-2). Nous avons effectivement souhaité éviter autant que possible la présence de micropores dans ces céramiques pour limiter leur dégradation prématurée et la perturbation du flux de perfusion. En complément de ce pourcentage de matière sèche nous avons donc choisi une température de frittage des céramiques en HA optimale favorisant l’élimination de ces micro- nano-pores : 1200 °C pendant 2 h sous air.

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Figure IV-5. A. Représentation schématique de l’imprimante 3D utilisée pour la production des moules en cire utilisés dans le procédé de fabrication des biocéramiques. B. Orientation des moules sur la plaque d’impression, l’axe indiqué représentant celui du plateau d’impression.