1. Organisation du bouton axonal
La ME est à la base des premières descriptions dans les années 50 de la structure des terminaisons présynaptiques, et de la découverte des VSs. Classi ue e t, l’o se atio de st u tu es iologi ues e ME e uie t u e tape de fi atio hi i ue de l’ ha tillo , u e incubation dans un colorant dense aux électrons et un enrobage dans une résine. Lorsque la résine est pol is e, l’ ha tillo peut t e oup fi e e t pou t e o se . Les te h i ues de oupe e pe ette t d’a o d pas d’o te i des se tio s suffisa e t fi es pou o se e e d tail les st u tu es p se tes à l’i t ieu du outo . Le développement d’ult a i oto es asso i s à l’utilisatio de outeau de dia a t e d possi le la p pa atio de section de 100 à 200 nm (Fernandez-Moran 1953, Porter & Blum 1953, Gay & Anderson 1954, Sjostrand 1958). L’a lio atio o sta te de ette te h i ue pe et aujou d’hui d’o te i des se tio s de d’ paisseu .
La p pa atio de se tio s d’ ha tillo s e ult a i oto ie a aussi pe is d’i age e ME des séries consécutives de sections (sections sériées) pour étudier en trois dimensions (3D) les structures cellulaires et subcellulaires. E Neu os ie es, ette te h i ue a t d’u e importance majeure pour décrire la connectivité des neurones et la morphologie des structures subneuronales (Harris & Stevens 1988, Harris & Stevens 1989). Cependant, elle permet d’o te i au ieu u e solutio de e z l’ paisseu de la oupe , e ui este insuffisant pour caractériser les structures moléculaires de la terminaison (Grimm et al. 1997). De plus, les fixateurs aldéhydiques utilisés pour immobiliser les structures tendent à agréger les filaments protéiques et à déformer les membranes, ce qui pose problème pour décrire les structures les plus fines de la terminaison (Rostaing et al. 2006).
Différentes méthodes de préparation des échantillons ont alors été progressivement mises au poi t afi de p se e les d tails de la te i aiso a a t de l’o se e e ME. Le « slam-freezing » est u e des p e i es thodes d’i o ilisation par congélation. Il consiste à appli ue à l’ ha tillo u i pa t su u lo de tal efroidi à -270°C (Heuser, Reese et al. 1979). L’asso iatio du ef oidisse e t apide et de la p essio e pa l’i pa t pe et
33 d’i o ilise apide e t les st u tu es. La o i aiso asse te p atu e/haute p essio pe et à l’eau o te ue da s la pa tie supe fi ielle des ha tillo s d’atteindre un stade de it ifi atio , plutôt ue d’ t e istallis e sous fo e de gla e. E effet, la fo atio de istau de glace altère les structures par son action mécanique. Les échantillons sont ensuite of a tu s pou e pose l’i t ieu des te inaisons. Pour observer les assemblages ol ulai es, l’eau est e suite eti e su à de p ofo deu pa su li atio supe fi ielle. Ap s u e tape d’o age a e u alliage de tau , o o tie t u e pli ue métallique de la structure de la terminaison, qui peut être observée en ME. Cette technique a pe is pou la p e i e fois d’o se e le seau de fila e ts st u tu a t la pa titio des vésicules dans le bouton (Landis et al. 1988, Hirokawa et al. 1989). Les vésicules apparaissent ete ues da s u seau de fila e ts d’a ti e et de i otu ules et atta h es les unes aux aut es pa des fila e ts fi s d’e i o de lo g (Fig. 5). La nature de ces filaments a été pa tielle e t lu id e g â e à l’ tude des te i aisons présynaptiques de souris Synapsine simple et triple KO (Takei et al. 1995, Gitler et al. 2004). On observe dans ces terminaisons une perte de 50% des VSs. Ces résultats, associés à la présence de Synapsine aux terminaisons et sa capacité à se lier aux VSs indiquent que la S apsi e pa ti ipe la ge e t à l’a u ulatio des VSs dans le bouton (De Camilli et al. 1983).
Figure 5 : Mise en évidence et modèle du réseau de filaments du bouton présynaptique. Les flèches indiquent des filaments liant les VSs entre elles (Hirokawa et al. 1989).
A. Mi og aphie d’u outo s apti ue de fi e oussue de e velet de rat après congélation rapide et cryofracture (Flèches : fila e ts elia t les VSs e t e elles . Ba e d’ helle : 100 nm.
B. Mod le d’o ga isatio des fila e ts du outo p s apti ue t : microtubules, a : filament
d’a ti e, si : Synapsine, sv : vésicule synaptique).
34 La congélation sous haute pression (CHP) utilise le même principe que le slam-freezing : une o g latio apide pa u jet d’azote sous t s haute p essio appli u da s u appa eil spécifique (High Pressure Machine, HPM). Cependant la pression de 2100 bars appliquée à l’ ha tillo da s l’HPM pe et de dui e e o e da a tage la fo atio de istau de gla e, et ainsi de it ifie l’ ha tillo , ais su u e paisseu plus g a de, d’au oi s μ (Siksou et al. 2009). L’ ha tillo peut e suite t e d sh d at , fixé au t t o de d’os iu à très basse température puis être enrobé dans une résine et coupé très finement (30 nm) pour être a al s e ME. Cette te h i ue pe et d’o se e les s apses sa s les a t fa ts i duits pa les fixateurs aldéhydiques, avec une résolution de 30 nm en z (Fig. 6).
Figure 6 : Comparaison de la morphologie de synapses excitatrices d’hippo a pe ap s fi atio chimique et
après CHP. Ba e d’ helle : 200 nm.
A. Mi og aphie d’u e s apse i o ilis e pa fi atio ald h di ue.
B. Mi og aphie d’u e synapse immobilisée par CHP.
Noter que le bouton synaptique a une forme plus arrondie et que les VSs apparaissent moins agrégées après CHP.
L’ tude des te i aiso s p s apti ues, e D et à u e solutio suffisa te pou observer les structures moléculaires a nécessité de nouveaux développements techniques. La to og aphie le t o i ue a t adapt e à l’ tude de sp i e s iologi ues da s les a es . Elle o siste à a u i e ME des i og aphies d’u ha tillo i lus da s u e se tio de résine de à d’ paisseu sous u e su essio p og essi e d’a gles d’i li aiso
35 (Baumeister et al. 1999, Fernandez-Busnadiego et al. 2010). Les images ainsi acquises sont ensuite réalignées et traitées informatiquement pour obtenir une reconstruction 3D de la st u tu e d’i t t. Cette te h i ue d’i age ie pe et d’o te i u e solutio d’e i o en z (Siksou et al. 2009).
Ap s i o ilisatio pa o g latio , l’ ha tillo peut gale e t t e ai te u à t s basse température (-140°C) dans un état hydraté pour être observé directement en oto og aphie to og aphie à t s asse te p atu e . Cette te h i ue pe et d’ iter les artéfacts éventuels induits par les étapes de déshydratation et de coloration, mais nécessite de travailler sur des échantillons très fins (moi s de , e ui e lut l’ tude de tissus.
Ces deu te h i ues de to og aphie o t pe is d’a al se l’o ga isatio du seau des filaments et des VSs dans les terminaisons (Fig. 7 ; Siksou et al. 2007, Fernandez-Busnadiego et al. 2010). Les VSs apparaissent interconnectées entre elles par des filaments de 30 nm de longueur, composés pour partie de Synapsine. Chaque VS est reliée en moyenne à 1 à 3 autres VSs. D’aut es t pes de fila e ts d’u e lo gueu de et de atu e o ide tifi e elie t également certaines VSs à la membrane plasmique au niveau du site de libération du neurotransmetteur. La terminaison présynaptique contient donc un réseau de filaments dense et o ple e ui pa ti ipe au e ute e t, au ai tie et à l’o ga isatio des V“s dans le bouton.
36 Figure 7 : Description du réseau de filaments du bouton présynaptique (A, B : Siksou et al. 2007 ; C : Fernandez-Busnadiego et al. 2010).
A. Se tio vi tuelle issue d’u to og a e d’u outo s apti ue d’u e s apse e itat i e
d’hippo a pe de sou is T te de fl he : filament, Flèche : VS a e à la )A . Ba e d’ helle : 200 nm.
B. Reconstruction du contenu du bouton à partir du tomogramme (Rose : filaments, Sphères jaunes : VSs, Sphères bleues : VSs ancrées à la ZA).
C. Re o stitutio du o te u d’u outo ap s oto og aphie Rouge : filaments, Sphères jaunes :
VSs . Ba e d’échelle : 50 nm.
A
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2. Les vésicules synaptiques
Les vésicules synaptiques sont les organelles renfermant le neurotransmetteur, du glutamate dans le cas d’u e ajo it des synapses excitatrices du SNC (Purves et al. 2004). Elles o t d’a o d t d ites o e ayant une morphologie variable suivant le type de synapse observée (Peters et al. 1991) : sphériques aux synapses excitatrices et pléiomorphiques (mélange de vésicules sphériques et aplaties) aux synapses inhibitrices. Cependant, il a été montré que les V“s des te i aiso s e itat i es ou i hi it i es s’aplatisse t à esu e ue la tonicité de la solution de fixation augmente (Valdivia 1971). D’aut e pa t, ap s i o ilisatio par congélation rapide sans fixateur aldéhydique, toutes les VSs des synapses apparaissent sph i ues et d’u dia t e o p is e t e et (Nakajima & Reese 1983, Tatsuoka & Reese 1989). Ces sultats i di ue t ue l’effet os oti ue des fi ateu s ald h di ues i duit u e d fo atio e a ai e des V“s. L’i o ilisatio pa o g latio appa aît do nécessaire pour étudier la morphologie des VSs.
D’u poi t de ue io hi i ue, la membrane des VSs présente un ratio protéine/lipide extrêmement élevé (60/40 en termes de masse ; Poudel & Bai 2014). On comptabilise 600 domaines transmembranaires par vésicule, ce qui suggère que la majorité de la surface membranaire est couverte de protéines. Ces protéines sont de plus très diverses ; 80 protéines différentes ont pu être identifiées par des approches de protéomique à partir de fractions de VSs purifiées (Fig. 8 ; Takamori et al. 2006). Une partie de ces protéines (protéines SNARE, S aptotag i e, Ra … est i pli u e da s les tapes du t afi des V“s ; elles seront décrites en détail dans les paragraphes suivants. Une autre partie des protéines vésiculaires permet la capture et le stockage du neurotransmetteur : aux synapses glutamatergiques, ces protéines sont les transporteurs du glutamate V-GluT 1 et 2, alimentés par un gradient électrochimique. Ce gradient est entretenu par une ATPase de type V, une pompe à proton dépenda te de l’ATP. Cet équipement protéique permet aux VSs d’assu e la o ti uit du le de li atio -recyclage.
38 Figure 8 : Modélisation d'une VS et des protéines associées à partir de données morphologiques, protéomiques et structurales (Takamori et al. 2006)
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3. Organisation de la zone active
La zone active est une structure spécialisée du bouton présynaptique, caractérisée en détail grâce à différentes études en ME (Palay 1956, Birks et al. 1960, Couteaux & Pecot-Dechavassine 1970). C’est u e po tion de membrane de 200 à 500 nm de diamètre en général pour les petites synapses excitatrices établies sur des épines. Cette membrane est associée à un réseau de macromolécules sur sa face cytoplasmique et est située en directe opposition à la DPS. Une partie des vésicules du bouton (10% pour ce type de synapse) se trouve en contact avec cette membrane, en rapport étroit avec le réseau de macromolécules. Ces vésicules associées à la membrane de la ZA sont dites « ancrées » à la ZA (Fig. 9A, B). La nature du contact entre ces si ules et la e a e a fait l’o jet d’u e o t o e se. E effet, plusieu s tudes ioph si ues p opose t u od le d’i te diai e d’h ifusio e t e la e a e vésiculaire et la membrane de la ZA, pour expliquer les aspects énergétiques du mécanisme de fusio o pl te des e a es lo s de l’e o tose (Kesavan et al. 2007, Chernomordik & Kozlov 2008). En outre, une étude réalisée en tomographie électronique montre des figures d’h ifusio à la )A de s apses o ti ales (Zampighi et al. 2006). Cependant, les synapses et synaptosomes immobilisés par congélation, sans fixateur aldéhydique, et observés en tomographie montrent clairement une apposition de la membrane des vésicules en contact avec la ZA, et non une hémifusion (Siksou et al. 2009, Fernandez-Busnadiego et al. 2010). L’utilisatio de fi ateu ald h di ue peut e pli ue les figu es d’h ifusio o se es. E effet, il a été montré que les aldéhydes induisent la fusion de vésicules avec la membrane plasmique (Smith & Reese 1980), et induisent des déformations membranaires (Rostaing et al. 2006). Les h ifusio s pou aie t do sulte de l’a ti it du fi ateu su les e anes des VSs et de la ZA.
Le réseau de macromolécules sur la fa e toplas i ue de la )A a d’a o d t d it g â e à l’utilisatio de olo atio s à l’a ide phosphotu gsti ue ou au is uth iodide a a t l’ tape d’e o age (Gray 1963, Bloom & Aghajanian 1966, Pfenninger et al. 1969, Triller &Korn 1985). Ces colorants, denses aux électrons, se fixent uniquement au matériel protéique et permettent do d’ tudie e ME la pa titio du at iel p ot i ue de la )A. E utilisa t es te h i ues, le réseau de macromolécules de la ZA apparaît comme une structure hexagonale d’a as de
40 matériel dense, appelée grille présynaptique, attachée à la membrane. Les vésicules ancrées sont disposées régulièrement entre ces amas (Peters et al. 1991, Triller & Korn 1985). Cepe da t, ette o ga isatio ’est pas isi le su les ha tillons immobilisés sans fixateur aldéhydiquepar des méthodes de congélation rapide. Les échantillons de cortex cerebelleux observés en ME après congélation rapide et cryofracture montrent que les molécules associées à la )A se p se te t sous la fo e d’u réseau de filaments fins connectés au VSs proches de la ZA La dis et al. , Hi oka a et al. . La dis et Reese fo t alo s l’h poth se ue l’utilisatio de fi ateu hi i ue ag ge les fila e ts e t e eu et i duit la fo atio d’a as autour des vésicules ancrées.
L’o ga isatio du at iel de se de la )A o se e pa La dis, Reese et Hi oka a a t o fi e et a a t is e fi e e t pa l’ tude de outo s s apti ues de t a hes d’hippo a pe e tomographie électronique après CHP et cryosubstitution (Siksou et al. 2007, Siksou et al. 2009). Les tomogrammes ainsi que les reconstructions en 3D du bouton montrent que les vésicules ancrées sont regroupées à proximité d’a as de matériel dense, et reliées à ces structures par de courts filaments (Fig. 9). Une étude ultérieure réalisée en cryotomographie sur des préparations de synaptosomes a confirmé la présence de ces fila e ts et l’a se e d’o ga isatio guli e du at iel de se de la )A (Fernandez Busnadiego et al. 2010).
41 Figure 9 : Etude en tomographie du matériel dense de la ZA (Siksou et al. 2009).
A. Deu se tio s vi tuelles de to og a e de )A d’u e s apse e itat i e d’hippo a pe Etoiles :
VSs ancrées).
B. et C. Deux sections virtuelles issues d’u e tomogramme (Etoile : VS ancrée, Flèches longues :
filaments reliant les VSs au matériel dense de la ZA, Têtes de flèches : petits filaments entre une VS ancrée et la membrane plasmique).
C. Reconstitution de la ZA, vues oblique et de face (Bleu : VSs ancrées, Jaune : filaments, Vert : membrane).
Ba es d’ helle : 50 nm.
De plus, la taille de la ZA est positivement corrélée au nombre de VSs ancrées (Fig. 10 ; Murthy et al. 2001, Holderith et al. 2012). Une étude réalisée en cryofracture et
A
42 immunohistochimie a également mis en évidence une corrélation positive entre la taille de la ZA et le nombre de CaV de type 2.1 à la terminaison (Fig. 10 ; Holderith et al. 2012). Ces canaux sont de plus exclusivement localisés à la ZA. Les CaV présents à la membrane de la ZA permettent une augmentation locale et rapide de la concentration de calcium à proximité des V“s a es lo s de l’a i e d’u pote tiel d’a tio à la te i aiso . Ils so t les ga a ts d’u e transmission rapide et fiable, et la ZA pourrait donc être impliquée dans leur organisation. Enfin, la taille de la ZA est corrélée à la taille de la DPS (Harris & Stevens 1989). La taille de la DPS est elle-même corrélée au nombre de récepteurs au glutamate de type AMPA (Takumi et al. 1999). Ainsi, la taille de la jonction synaptique (ZA et DPS) semble être un facteur d te i a t de l’effi a it de la t a s issio synaptique.
Figure 10 : Corrélation de la taille de la ZA au nombre de VSs ancrées et au nombre de CaV (Holderith et al. 2012).
A : Corrélation du nombre de VSs ancrées à la taille de la ZA.
B : I u olo alisatio des CaV ap s of a tu e d’u e s apse de la ou he CA de l’hippo a pe t :
te i aiso p s apti ue ; a e d’ helle : .
C : Corrélation du nombre de CaV à la terminaison à la taille de la ZA (Noir : animal 1, Rouge : animal 2).
43
II. Fonctionnement de la zone active
Le réseau de macromolécules complexe de la zone active organise et régule la libération de neurotransmetteur dans la fente synaptique. Il assure différentes fonctions cruciales pour la transmission nerveuse : ’est le lieu de l’a age des si ules s aptique face à la DPS, ancrage p e uis pou la fusio d’u e si ule et la li atio de eu ot a s etteu . “o o ga isatio pe et de ouple l’e t e de al iu da s le outo , suite à l’a i e d’u pote tiel d’a tio , à la fusio d’u e pa tie des V“s ancrées. Enfin, les molécules de la ZA participent également à la plasti it à ou t et lo g te e de la te i aiso p s apti ue. La )A pe et do d’assu e une transmission fiable, efficace et régulable (Sudhof 2012). Nous allo s d’a o d p se te le mécanisme de fusion des VSs avec la membrane plasmique à la ZA, puis le mécanisme de recrutement des VSs à la ZA, préalablement à la fusion.