1. Fusion des vésicules à la zone active
L’a i e d’u pote tiel d’a tio à la te i aiso p s apti ue i duit u e d pola isatio de la e a e du outo . Cette d pola isatio p o o ue l’ou e tu e de a au al i ues d pe da ts du oltage p se ts da s la e a e plas i ue. L’aug e tation locale de al iu i t a ellulai e e t aî e des e e ts de fusio s h o is s a e l’a i e du pote tiel d’a tio , et l’e o tose est alo s dite o u e. Des e e ts de fusio peu e t gale e t se p odui e sto hasti ue e t, e l’a se e de pote tiel d’a tio ; on parle dans ce cas de libération spontanée.
La fusion des vésicules à la ZA été visualisée en ME à la jonction neuromusculaire de grenouille (Heuser & Reese 1981) ainsi que plus récemment sur des synapses de neurones hippocampaux de rat en culture (Watanabe et al. 2013). Dans ces deux études, les auteurs appli ue t u e sti ulatio à la p pa atio a a t de l’i o ilise pa o g latio afi de « capturer » des images de fusion à la ZA. Ils observent des figures en Omega correspondant à des VSs en fusion avec la membrane plasmique, dans un délai de quelques ms après la
44 stimulation (Fig. 11). Ce délai est probablement dû aux conditions expérimentales. En effet, des do es le t oph siologi ues i di ue t ue le d lai e t e l’a i e du pote tiel d’a tio et la fusion des VSs est inférieur à 1ms (Sabatini & Regehr 1996).
Figure 11 : Visualisatio de l’e o tose à la jonction neuromusculaire de grenouille en ME (Heuser & Reese 1981).
1. Mi og aphie d’u e te i aiso o sti ul e.
2. Mi og aphie d’u e te i aiso sti ul e ; la membrane plasmique présente des déformations
correspondant à des figures de fusion et la terminaison contient un nombre réduit de VSs comparativement à la figure 1.
2. Probabilité de libération du neurotransmetteur
La p o a ilit de li atio Pl à l’ helle d’u e te i aison présynaptique est définie o e la p o a ilit de fusio d’u e ou plusieu s V“s à la zo e a ti e e po se à u pote tiel d’a tio . C’est u des pa a t es d te i a ts de l’effi a it de la t a s issio . Elle peut être évaluée grâce à des techniques de i os opie opti ue à l’aide de diff e ts
45 colorants fluorescents, ajoutés au milieu extracellulaire et ha g s à l’i t ieu des V“s pa u e première série de stimulations (Betz & Bewick 1992, Granseth et al. 2006, Yang & Calakos 2013). Les sti ulatio s sui a tes i duise t des e e ts d’e o tose ui peu e t t e visualisés grâce à la libération du colorant contenu dans les VSs. Le niveau de fluorescence do e a s à u e i di atio du o e d’ e e ts de li atio . On peut ainsi en déduire la p o a ilit d’ e e ts de li atio pa pote tiel d’a tio . U e aut e thode s’appuie sur les évènements calciques induits par la libération de neurotransmetteur au niveau des épines postsynaptiques (Emptage et al. 1999). Elle consiste à stimuler à basse fréquence des eu o es e plis d’u i di ateu al i ue fluo es e t. Les aug e tatio s de fluo es e e détectées au niveau des épines dendritiques traduisent une augmentation de la concentration posts apti ue de al iu . Cha ue l atio de al iu e po se à u pote tiel d’a tio reflète un ou plusieurs évènements de libération évoquée de neurotransmetteur. Le nombre d’aug e tatio de la fluorescence par stimulation indique alors directement la Pl de la synapse observée. En ME on peut évaluer la Pl en stimulant un neurone en présence de colorant dans le milieu extracellulaire (Murthy et al. 1997). On peut ainsi compter le nombre de VSs reformées pour un nombre donné de stimulations. Ces thodes o t pe is d’ alue u’il a e t e 0.3 et . V“s li es pa pote tiel d’a tio aux synapses e itat i es d’hippo a pe. D’u poi t de vue structural, la Pl est corrélée positivement à la taille de la ZA et au nombre de VSs ancrées (Fig. 12 ; Murthy et al. 2001, Branco et al. 2010, Holderith et al. 2012).
46 Figure 12 : Corrélations positives de la Pl à la taille de la ZA (A, Holderith et al. 2012) et au nombre de VSs ancrées à la ZA (B, Branco et al. 2010).
3. Assemblage du complexe SNARE et rôle dans la fusion
Les protéines SNARE (pour « soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor ») sont nécessaires à différents processus de fusion de vésicules dans les cellules eucaryotes (Rothman 1994). Ces protéines ont pour particularité de posséder un ou plusieurs domaines SNARE, des domaines « coiled-coil » fo a t des h li es alpha ui peu e t s’asso ie entre elles.
Le ôle esse tiel des p ot i es “NARE da s l’e o tose des V“s a t d ou e t grâce à l’ tude de l’effet des eu oto i es otuli ue et t ta i ue su le fo tio e e t s apti ue. Différents sous-types de ces toxines clivent spécifiquement la Synaptobrévine2, SNAP25 ou la Syntaxine1, trois protéines des terminaisons présynaptiques du SNC, tout en bloquant les évènements de fusion (Link et al. 1992, Blasi et al. 1993a, Blasi et al. 1993b). Ces protéines ont ensuite été identifiées comme des protéines de la famille SNARE (Sollner et al. 1993). La Syntaxine1 et SNAP-25 sont associées à la membrane plasmique, tandis que la Synaptobrévine2 ou « vesicle-associated membrane protein 2» (VAMP2) est une protéine de la membrane
47 vésiculaire (Fig. 13). Ces trois protéines interagissent pour former un complexe à 4 hélices qui maintient la VS en contact étroit avec la membrane plasmique au niveau de la ZA, dans une conformation favorisant la fusion ultérieure des membranes.
Figure 13 : S h a de l’asse lage du o ple e SNARE (Tang et al. 2006).
D’aut es ol ules de la )A so t i pli u es da s le a is e de fusio des V“s. Les protéines Munc et Mu so t i dispe sa les à l’e o tose et agi aie t e pe etta t l’assemblage du complexe SNARE (Sudhof 2012). Le gène unc18 et son rôle dans le fonctionnement de la terminaison présynaptique ont été identifiés chez le nématode
Caenorhabditis elegans. L’ho ologue de la p ot i e U hez la sou is, Munc18, est indispensable à la libération du neurotransmetteur (Verhage et al. 2000). Paradoxalement, il a t o t u’elle i te agit a e la “ ta i e, e ai te a t elle-ci dans une configuration fermée ne pouvant pas interagir avec SNAP25 et la Synaptobrévine (Hata et al. 1993, Jahn & Fasshauer 2012). Son rôle reste encore mal compris ; en effet, la délétion du gène munc18 est létale y compris pour des neurones en culture, e ui e d l’ tude de sa fo tio particulièrement compliquée (Heeroma et al. 2004).
Comme pour Munc18, le gène unc13 a été identifié dans un premier temps chez
Caenorhabditis elegans (Brenner 1974). Trois gènes homologues ont ensuite été mis en
évidence chez les mammifères, munc13-1, 13-2 et 13-3 (Brose et al. 1995). La famille de protéines Munc13 est exprimée aux terminaisons nerveuses et est essentielle à la libération de neurotransmetteur. Le rôle de Munc da s l’e o tose a fait l’o jet d’u e s ie d’ tudes
48 réalisées sur différents modèles : Caenorhabditis elegans (Richmond et al. 1999), Drosophila
melanogaster (Aravamudan et al. 1999) et la souris (Varoqueaux et al. 2002). Chez ces 3
espèces, la délétion de unc13, Dunc13 et Munc13, respectivement, provoque un blocage total de l’e o tose o u e et spo ta e. Ces tudes o t pe is de o lu e au ôle esse tiel de Munc13 et ses homologues dans la fusion des VSs à la )A. Le a is e d’a tio de Mu reste pour le moment à l’ tat de od le h poth ti ue. Les protéines Munc13 ont pour particularité de posséder un domaine MUN et un domaine C2A indépendant du calcium. La ise e ide e d’interactions de Munc13 avec Munc18, et du domaine MUN avec la forme fermée de la Syntaxine1, suggère que Munc13 permet à la Syntaxine1 de passer de sa conformation fermée à u e fo e ou e te, pe etta t l’asse lage du o ple e “NARE (Sudhof 2013). Ai si, les effets d’u e i a ti atio de u hez Caenorhabditis elegans sont a olis pa l’e p essio d’u e fo e constitutivement ouverte de la Syntaxine (Richmond et al. 2001).
La Synaptotagmine1 est une protéine transmembranaire des VSs (Matthew et al. 1981). En face cytoplasmique, elle contient deux domaines C2 qui interagissent avec les ions calcium. Cette interaction permet à la Synaptotagmine1 de se lier aux phospholipides membranaires (Brose et al. 1992). Elle interagit également avec le complexe SNARE en se liant à la Syntaxine1 (Sollner et al. 1993). Des études de la transmission chez des animaux KO pour la “ aptotag i e o t pe is de o t e ue ette p ot i e est essai e à l’e o tose d pe da te du al iu . D’aut e pa t, la du tio de l’affi it de la “ aptotag i e au calcium par des manipulations génétiques entraîne une diminution des évènements de fusion dépendant du calcium (Fernandez-Chacon et al. 2001). L’e se le de es do es sugg e ue la Synaptotagmine1 joue le ôle de se seu al i ue da s l’e o tose o u e (Rizo et al. 2006).
La Complexine a été identifiée en raison de son affinité pour le complexe SNARE (McMahon et al. 1995). Elle agi ait o e u ofa teu de l’a ti it de la “ aptotag i e dans l’e o tose o u e. E effet, les a i au KO pou la Co ple i e p se te t u e di i utio de l’e o tose o u e et u e aug e tatio de l’e o tose spo ta e (Reim et al. 2001). La
49 Complexine interviendrait en amont de la Synaptotagmine : en se liant au complexe SNARE, elle stabiliserait celui-ci dans une forme métastable qui ne peut pas engager la fusion de la VS à la membrane de la ZA. La liaison de calcium à la Synaptotagmine libèrerait la Complexine du complexe SNARE (Giraudo et al. 2006, Tang et al. 2006). L’i te a tio entre la Synaptotagmine et la Co ple i e pe ett ait ai si de ouple la li atio des V“s à l’e t e de al iu da s la te i aiso et d’i hi e les e e ts de li atio as h o e.
Le mécanisme exact de la fusion des membranes de la ZA et des VSs reste encore mal o p is. L’assemblage du complexe SNARE et des protéines associées exercerait une tension mécanique suffisante pour entraîner la fusion des membranes (Kesavan et al. 2007, Bretou et al. 2008). Il e sulte ait l’ou e tu e d’u po e de fusio ui pou ait s’ la gi pa la suite. Ap s la fusio , le o ple e “NARE est d sasse l pa la liaiso d’u e ATPase, la N“F, a e SNAP25 (Rizo & Rosenmund 2008). L’e se le des p ot i es i pli u es da s la fusio peut alors à nouveau participer à l’e o tose des V“s.
4. Rôle de RIM
Les protéines RIM (Rab3 Interacting Molecule) sont des protéines multi-domaines identifiées comme des protéines de la ZA grâce à leur interaction avec la protéine vésiculaire Rab3 (Wang et al. 1997). Le génome des Vertébrés comporte 4 gènes codant pour des protéines RIM, chacune pouvant être exprimé sous 1 à 3 isoformes différentes : α, β et γ (Wang & Sudhof 2003, Kaeser 2011). A la terminaison présynaptique, seule la protéine RIM1, forme ajo itai e, et la p ot i e RIM so t e p i es. “ous leu isofo e α, elles poss de t u g a d o e de do ai es d’i te a tio a e les p ot i es de la )A (Fig. 14 ; Coppola et al. 2001, Kaeser et al. 2011) :
- une hélice alpha, do ai e d’i te a tio a e Ra
- un domaine en doigt de zinc N-terminal qui interagit avec le domaine C2A de Munc13 - un domaine PDZ qui se lie aux canaux calciques dépendant du voltage (CaV) de type N, P
50 - un domaine C2A qui interagit avec SNAP25 et la Synaptotagmine1
- une séquence riche en proline qui lie la RIM Binding Protein (RIM-BP)
- un domaine C2B C-terminal interagissant également avec qui interagit avec SNAP25 et la Synaptotagmine1
Figure 14 : Représentation schématique des do ai es d’i te a tio de la p ot ine RIM et de leurs fonctions potentielles. Le « priming » ou amorçage des VSs est décrit dans le chapitre suivant (Kaeser 2011).
Les isofo es β et γ so t e p i es sous le o t ôle de p o oteu s diff e ts et poss de t oi s de do ai es d’i te a tio . RIM β et RIM β o po te t u e ou te s ue e β– spécifique, des domaines PDZ et C2A centraux, et un domaine C2B C-terminal : elles ne peuvent do pas i te agi a e Mu et Ra . RIM γ poss de u i ue e t u do ai e C B.
RIM intervient indirectement dans le mécanisme de libération, via différentes interactions avec les molé ules i pli u es da s la fusio des V“s. E l’absence de la protéine RIM, Munc13 est p se te à la te i aiso sous la fo e d’ho odi e, li e par l’i te a tio des domaines C2A N terminaux (Fig. 14A ; Lu et al. 2006, Deng et al. 2011). Cette forme ne peut pas interagir a e la “ ta i e . L’i te a tion du domaine C2A de Munc13 avec le domaine en doigt de zinc de RIM provoque la dissociation de l’ho odi e ; les monomère Munc13 peuvent alors pa ti ipe à l’asse lage du o ple e “NARE. D’aut e pa t, les do ai es d’i te a tio au CaV et RIM-BP pe ette t la fo atio d’u o ple e t ipartite qui est impliqué dans le recrutement des CaV à proximité du complexe SNARE. Cette localisation des CaV permet une augmentation rapide de la concentration de calcium, suffisante pour déclencher la fusion de
synaptic vesicles
51 VSs (Hibino et al. 2002, Han et al. 2011). RIM interagit également avec la protéine Rab3, une GTPase présente exclusivement à la membrane des VSs, dans sa conformation liée au GTP (Fischer von Mollard et al. 1990). Rab3 a un rôle de régulateur de la fusion évoquée des VSs ; elle pourrait être impliquée dans la formation du complexe SNARE ainsi que dans la régulation de la se si ilit de l’e o tose au al iu (Johannes et al. 1996, Yamaguchi et al. 2002, Schluter et al. 2004). Il a été montré que RIM forme avec Munc13 et Rab3 un complexe tripartite ; le rôle de ce complexe dans la régulation de la fusion évoquée est encore méconnu (Dulubova et al. 2005). L’e se le des i te a tio s d ites da s e hapit e est su pa la figu e B, tirée d’u e e ue de Tho as Sudhof (Sudhof 2013).
Figure 15 : Rôle de RIM da s l’asse lage du o ple e SNARE.
A. Rep se tatio s h ati ue de l’i te a tio des p otéines RIM et Munc pe etta t l’a tivatio
de Munc13 et son interaction avec les protéines SNARE (Deng et al. 2011).
B. Représentation schématique des protéines de la ZA. Noter le rôle central de la protéine RIM (Sudhof 2013).
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